实验动物设施中牛棒状杆菌感染的防治策略

黎 明

[诺华(中国)生物医学研究有限公司, 上海 201203]

牛棒状杆菌(Corynebacterium bovis，C. bovis)是一种革兰氏阳性细菌，菌体短小，一端或两端膨大呈棒状，无荚膜，无鞭毛，不产生芽胞，多为条件致病菌，属于棒状杆菌科。该细菌常见于奶牛乳腺感染中，与奶牛产奶量减少和乳腺炎有关[1-4]。同时，C. bovis 被认为是免疫缺陷裸小鼠(Foxn1, nu/nu)的一种条件性致病菌，会导致裸小鼠角化过度皮炎(鳞状皮肤病)[5]。1982 年日本首次公开报道了无胸腺裸小鼠的全身性角化过度皮炎感染(临床症状为背部皮肤出现鳞状皮屑)，随后美国和意大利也分别在1990年和1997年发现了该感染[6]。在1997 年Scanziani 等[7]报道，C.bovis在裸小鼠中的传播速度非常迅速，感染该细菌后7~10 d 发病率可有 80%~100%，死亡率相对并不高，大约在1%左右，感染后的临床症状一般会在7~10 d 后自发性消失。显微镜下，该细菌感染造成的皮肤组织学病变特点是明显的棘皮病、角化过度、稀疏的粒细胞和单核细胞浸润真皮层[7-9]。Clifford 等[10]实验表明，免疫正常的有毛小鼠(CD-1 和杂合子裸小鼠)与 C. bovis 感染的裸小鼠饲养在一起时也能够被感染，但是并不会出现任何临床症状或角化过度的组织学变化。与之相反，免疫正常的无毛SKH-1 小鼠饲养在上述相同饲养条件下被感染后出现了肉眼可见的皮屑症状，并且显示出组织学角化过度皮炎的损伤。有报道[10]认为，免疫正常的有毛小鼠(如 ICR)会被短暂感染，但小鼠可能会自行将C. bovis 清除。

另外，有毛的免疫缺陷小鼠(如SCID)被C. bovis 感染后可能也会出现皮屑或脱毛的症状[6]。这表明，动物无毛和免疫缺陷可能是易感C. bovis的两个关键因素。被感染的小鼠由于脱水或厌食症会体质量下降。免疫缺陷裸小鼠感染该细菌后尽管临床症状可能会自发消失，但是感染似乎是终身伴随的。

近年来，随着免疫缺陷裸小鼠在国内的广泛使用，该细菌引起的设施污染及裸小鼠“鳞皮病”也逐步引起国内各个设施和机构的重视。2019 年，邢进等[11]编制了C. bovis 检测的团体标准，该标准提供和规范了C. bovis 的检测方法，有助于该细菌的及时发现与控制。冯洁等[12]建立了一种C. bovis 环介导等温扩增(LAMP)的快速检测方法，该方法根据C.bovis 的16S rRNA 基因保守区域设计一组特异性引物进行扩增。此方法操作简单、快速高效，结果易于观察，对仪器设备要求低，可用于C. bovis 的快速检测。

1 C. bovis 对设施环境以及科研实 验的影响

实验动物设施一旦被C. bovis 感染后很难彻底清除，尤其是饲养裸小鼠和其他免疫缺陷小鼠的设施，并且会对设施内小鼠种群的管理形成持续的挑战。除了进行彻底的种群扑杀和设施的消毒灭菌，目前对该细菌其他有效处理措施的知识和报道非常少[7]。作者在与受C. bovis 影响的机构的交流中认识到，无论是科研机构还是医药工业界的动物设施，C. bovis 在裸小鼠种群中都是一种常见的病原菌。在科研机构， 很难实现彻底的种群扑杀和严格限制外来动物的进入，因此对该细菌进行有效控制并清除出动物种群是一个非常大的挑战。Burr 等[13]实验结果提示，对实验中感染C. bovis 的小鼠进行抗生素预防和治疗是没有意义的，该细菌非常难以根除，感染相关的严重临床症状可能是多因素导致的。而且使用微膜隔离笼将裸小鼠饲养在 C. bovis 污染的动物房内，并不能阻止动物被感染。目前，随着各国之间实验动物资源的共享与频繁交流，各机构的动物引进以及人源异种移植(patient-derived xenograft，PDX)模型或成为该污染的重要来源。

由于免疫缺陷小鼠感染C. bovis 后会出现脱水和身体健康状况下降等临床症状，动物对受试药物的不良反应会增强，耐受性变差，从而影响实验数据的准确性。尽管小鼠感染C. bovis后临床症状持续的时间较短，但该细菌会严重影响异种移植的肿瘤生长，导致肿瘤生长缓慢、推迟甚至是不生长[10]。感染还会造成小鼠对化疗敏感性增加。因此，该细菌的感染对肿瘤学研究的危害极大。另外，小鼠感染该细菌后会导致皮肤的组织学发生改变，比如：棘层增厚、角化过度(鳞状皮屑)和真皮层内的炎性浸润等[6]。综上所述，免疫缺陷小鼠感染 C. bovis 后不适合再用于实验研究。

2 对C. bovis 的研究进展

目前，国内对啮齿类动物感染 C. bovis 的研究报道极少。但是由于该细菌对实验动物设施，尤其是免疫缺陷小鼠设施的危害极大，中国实验动物学会 2017 年发布了《实验动物 牛棒状杆菌检测方法》T/CALAS—2017，并且该细菌在国内越来越受到重视，各实验动物供应商以及越来越多的实验动物使用单位都将 C. bovis 纳入了单位内部的 SPF 小鼠病原菌排除列表。

Gobbi 等[14]对C. bovis 在意大利多个设施污染情况的分析显示，免疫正常的有毛小鼠和受感染的裸小鼠饲养在同一房间，免疫正常的小鼠皮肤上也能检测到该细菌，但是细菌数量远远低于免疫缺陷裸小鼠；微膜隔离笼只能阻止部分的C. bovis 传播，不能完全隔绝污染的传播。免疫正常的有毛小鼠不太可能是C. bovis 的宿主，因为该细菌只在与被感染的裸小鼠一起饲养的小鼠中检测到。Scanziani 等[6]实验研究了来自6 个不同设施共 28 只 CB-17 SCID 小鼠，有 10 只小鼠的皮肤中检测到 C. bovis，其中 2 只症状较为严重(面部、背部、脸颊区域脱毛)，另外8 只无肉眼可见的皮肤症状，但镜下皮肤组织学检查能够观察到病变。这表明SCID 小鼠可能是该细菌的潜在宿主之一，并能传播给其他动物。与裸小鼠相比，被感染的 SCID 小鼠皮肤病变程度较低，感染率也明显低于裸小鼠。

Cheleuitte-Nieves 等[15]对从人、牛以及啮齿类动物中分离得到的 21 株不同来源的C. bovis 菌株进行了基因组测序分析，结果显示人和牛宿主来源的菌株具有较高的基因型相似性，但与啮齿类动物来源的菌株差异较大，后者中分离得到的菌株具有更强的致病性。Dole 等[16]对3 株不同来源的C. bovis 进行的实验结果证实，“鳞状皮肤病”小鼠身上分离得到的菌株致病性和发病速度明显强或快于牛来源的菌株(ATCC 7715)和无症状小鼠身上分离得到的菌株。和开放式笼盒饲养相比，微滤膜隔离笼并不会明显降低 C. bovis 的发病率。该细菌可以通过操作者的手套或通过空气中悬浮粒子的携带在免疫缺陷小鼠间快速传播(4 d)。Burr 等[13]研究发现，无论是将阿莫西林加入饲料中进行预防性给药或治疗，还是使用青霉素-链霉素对感染动物进行体表喷雾，都不能对C. bovis 进行有效的预防和治疗。并且使用9 种不同抗生素进行的药敏试验也未筛选到对该细菌敏感的治疗方案。因此，单一通过抗生素的手段对该细菌进行预防和治疗可能很难实现。

3 对 C. bovis 污染设施的清理方法

Burr 等[17]的实验表明，即使采用严格的饲养和操作标准，动物使用独立通风笼具(IVC)进行饲养，换笼等操作全部在生物安全柜中进行，仍不能有效控制 C. bovis 在裸小鼠房间内的传播。该细菌能够在受感染的饲养室环境中大范围扩散，其传播途径主要是通过生物安全柜内的换笼发生。该细菌具有亲脂特性并且能够很好地存活于皮肤碎屑和其他有机体，因此能够在环境中长期生存。很多科研机构由于动物模型的唯一性和特殊性，并不适合进行大范围的种群扑杀，因此一旦发生C.bovis 污染，动物设施管理人员很难控制污染的扩散。

随着动物病原菌筛查技术手段的进步，Manuel等[5]利用 PCR 定期检测排风管粉尘(exhaust air dust，EAD)的技术制定出能够快速、准确检测到 C. bovis 的方案，他们认为常规的笼架清洗消毒(经自动洗笼机 82 ℃热水冲洗)并不能完全灭活该细菌，只有彻底的高压灭菌才可以将细菌完全杀灭。动物被C. bovis 感染后 7 d(感染早期)，即可在 IVC 水平排风管处的 EAD 检测到C. bovis的DNA 阳性。如果动物正处于细菌扩增高峰期，仅需 1 d 就能在排风管处检测到C. bovis 的DNA。该方法具有高度敏感性，笼架上即使只有一笼被感染的动物，也可以在EAD 中检测到C. bovis，并且不受笼盒内动物数量的影响。

在另一篇报道中，Manuel 等[18]介绍了一种PDX 模型传代的无菌操作技术，成功清除了PDX荷瘤鼠上的C. bovis。应用该操作技术，实现了共 480 只裸小鼠的肿瘤传代，未发生一例C. bovis感染。操作由两人配合完成，其中一人负责在感染房间进行肿瘤取材， 另一人负责在未感染的房间进行肿瘤细胞的传代接种操作。Manuel 等[19]利用EAD 的 PCR 定期检测总结出一套有效的操作方法，成功实现了对C. bovis 的快速检测和清除，截至文章发表时仍然保持设施无 C. bovis 污染。具体方法为：① 每周对笼架进行EAD 的 PCR 检测，如果出现C. bovis 阳性，对该笼架进行复检；②如果结果仍是阳性，将该笼架从饲养室移出；③ 将所有笼盒转移到干净的空笼架上等待 24 h；④ 24 h后，对每个水平排风管进行取样检测，确定阳性感染在哪一排；⑤ 再对该排的每个笼盒进行取样检测，确定具体的被感染笼盒位置，将被感染的笼盒移除；⑥ 将剩余所有笼盒再次转移到干净的空笼架上，7~10 d 后对该笼架进行复检；⑦ C.bovis 复检结果如是阴性，则将所有笼盒转回未受感染的饲养间；⑧ 复检结果如是阳性，则重复上述①~ ⑤的步骤。

另外，该文章中的3 个污染案例证明，液氮冻存的 C. bovis 感染肿瘤组织或细胞仍具有感染性；单纯检测液氮冻存的肿瘤组织会降低 PCR 检测的敏感性，检测肿瘤组织和其培养液的混合物可大大提高C. bovis 的检出率。被感染的肿瘤冻存组织与新鲜组织相比，在小鼠体内接种后，其症状发病时间可能会推迟4 周左右。

4 预防C. bovis 污染的策略

上述 Manuel等[18]的报道提出了一套切实可行的清除C. bovis 污染的程序，但是如何预防该细菌在设施内的污染在目前并没有较好的解决方法。根据现有公开报道和同行之间的交流，PDX模型是目前屏障内 C. bovis 污染的一个主要来源。笔者根据该细菌的感染和传播特点，以及国内外的研究进展，经过过去6 年对2 个实验动物设施超过 70 例的 PDX 肿瘤模型的追踪，总结出一套可能可以有效预防屏障内C. bovis 污染的策略。具体方法关键点如下：

4.1 设定一个专门的饲养间作为潜在 C. bovis 污 染风险的房间

① 该房间相对相邻区域为负压，使用质量可靠的负压 IVC 进行饲养；

② 佩戴双层手套进入该房间，所有打开笼盒的操作必须在生物安全柜内进行；

③在房间内需频繁对手部进行喷雾消毒，不同笼盒之间操作时必须消毒手部；

④不得将动物转移到其他房间，不得和其他房间共享耗材或设备等；

⑤从该房间退出需脱掉第一层手套，并对手部消毒；

⑥ 在免疫缺陷鼠饲养区域，该房间的进入顺序应放在最后，并尽可能减少进出次数；

⑦ 所有临床来源的患者肿瘤组织、未知C. bovis 感染状况的 PDX 组织都应在该房间操作。

4.2 肿瘤异种移植无菌操作

① 进行操作的房间不应设立在C. bovis 污染区；

② 对液氮冻存的C. bovis 污染的肿瘤组织，采用有毛的重度免疫缺陷小鼠(如 NSG、SCID 等)进行接种；

③ 荷瘤鼠必须在原饲养盒内使用二氧化碳施行安死术，操作需在生物安全柜内进行；

④ 整个小鼠尸体必须完全浸泡在消毒液Spor-Klenz 中至少 5 min；

⑤ 肿瘤组织取材时使用两套无菌手术器械，避免接触肿瘤和接触皮肤的器械交叉污染；

⑥ 取下的肿瘤组织需放入添加 1%青霉素-链霉素的转移培养液中；

⑦ 传代接种的操作需在另一未受 C. bovis 污染的房间进行，并严格满足无菌操作的要求。

4.3 肿瘤移植后的荷瘤鼠的检测筛查

① 小鼠放入上述专门的饲养间，使用单独的 IVC 笼架进行饲养；

② 移植后 12 d，对小鼠皮肤行棉拭子采样，进行 C. bovis 的实时荧光定量 PCR 检测。如结果阳性，立即将该笼动物施行安死术；如结果阴性，将该笼动物转移到另外一个 IVC 笼架饲养，移植后 26 d，重复上述 ② 操作；

③笼盒两周更换一次，除上述皮肤棉拭子采样，不得有其他打开笼盖的操作；

④未经过 PCR 检测验证的笼架或笼盒，换笼应放在最后；

⑤ 加强动物的日常观察，发现任何疑似C. bovis 感染(脱毛、皮屑、红肿的面部或耳朵)的动物应立即做好标记，第2 日确认症状未消失的，该笼动物应立即移出屏障并施行安死术。

通过上述预防策略，笔者管理的设施过去6 年未发生一例C. bovis 的感染，原先受污染的肿瘤组织也通过该方法得到了净化，证明这可能是一个有效的预防污染策略。

5 结语

随着 PDX 模型的应用越来越普遍，C. bovis作为一种条件致病菌，在各个实验动物设施内普遍存在，对设施管理、种群安全和科学研究造成了极大的挑战。目前，国内绝大多数实验动物设施对于C. bovis 污染几乎束手无策，一旦发生污染只能任其在设施内蔓延，由于该细菌对免疫功能正常的有毛小鼠只是短暂性感染并且不产生临床症状，因此该细菌对设施的污染并未引起足够重视。笔者所采用的防治策略和上述 Manuel 等[18-19]在 2017 年报道的方法基本类似，经过几年的长期验证，在各自独立的设施内都很好控制了污染，证明该方法策略可能确实是控制 C. bovis 污染的一个有效措施。