表皮紧密连接在特应性皮炎发病机制中的作用

刘 宇 李 萍 王 燕 底婷婷 蒙玉娇 赵京霞

特应性皮炎是一种慢性炎性皮肤病，以瘙痒和反复发作的湿疹样皮损病变为主要临床表现，婴幼儿中多发，给患者及其家庭带来极大的心理和经济负担。该疾病发病机制复杂，免疫系统中Th2、Th1失衡和过敏原诱发IgE增多引起的过敏反应都是发病中的一部分，而先天或者后天获得性皮肤屏障功能受损在AD的发病中被认为是发病初始阶段，紧密连接则作为表皮屏障的主要调控因子发挥着重要作用。

一、表皮紧密连接的结构与功能

紧密连接(tight junction,TJ)包括多种跨膜蛋白和胞内蛋白，主要有Claudin家族、Occludin家族、ZO家族、黏附分子家族(JAMs)、Symplekin蛋白等。这些蛋白在细胞产生极性及分化的过程中相互交联，最终形成致密网状结构，封锁细胞间隙[1]。

Claudin蛋白是TJ结构的主要组成部分,参与维持TJ的栅栏功能和屏障功能。它主要表达在表皮颗粒层角质细胞的细胞膜上，呈网状结构。Claudin蛋白是维持TJ结构和功能的重要组成之一,研究发现，Claudin-1表达缺失的小鼠出现了表皮屏障的受损及炎性反应，严重缺失小鼠在出生1天内死亡[2]。Occludin蛋白主要表达在表皮颗粒层细胞的胞膜及胞质中，是角质形成细胞分化的标记之一，负责调控亲水性小分子的细胞旁弥散，与细胞内弥散屏障的形成有关。ZO蛋白在TJ中起到“骨架”的作用，它们作为与肌动蛋白细胞骨架相关的复合物支架可以与多种连接蛋白互相作用，同黏附分子(JAMs)一起形成致密的连接结构[3]。

Hanel等[4]形容这一种致密网状结构是防止水和溶质过量损失的水液屏障；Anderson等[5]研究认为紧密连接不仅仅是物理性地屏障，它可以有选择性地通过离子等物质，因而被紧密连接隔离的两个相邻的空间可以存在不同浓度的溶质。Gruber等[6]用离子示踪的方法证实了紧密连接的存在以及它有效维持两侧稳态的作用，证明了紧密连接是渗透性阻隔的有效成分，主要调节水和溶质的细胞间转运[7]。另外，TJ可以通过影响信号级联反应来控制细胞增殖和分化，它还被证实可以影响免疫细胞的迁移以及炎性因子的游移[8，9]。

二、AD中存在着紧密连接的破坏

AD患者皮肤中存在着表皮屏障的功能障碍。而紧密连接作为其重要的调节因子，也被证实在AD中存在异常[10]。Bergmann等[11]分别检测了AD患者皮损、非皮损以及健康皮肤中Claudin-1的表达水平发现，AD患者皮损、非皮损部位的Claudin-1较健康皮肤中的表达量是明显下降的。但是有意思的是，AD患者非皮损部位的经皮水分丢失与健康皮肤比较差异无统计学意义。Yuki等[12]研究发现，AD患者皮损中Claudin-1和ZO-1的表达水平降低，同时在所有的非皮损部位出现ZO-1表达的减少，部分非皮损部位还出现了Claudin-4表达的下降。Altunbulakli 等[13]检测了来自AD患者和健康人的皮肤基因表达水平，发现AD患者的皮损区及非皮损区的Claudin-1以及Occludin的基因表达水平较健康人是明显降低的；但是与细胞内骨架蛋白相连接的ZO-1、ZO-2的基因表达水平是明显升高的。这与Yuki等[12]的研究结果相反，可能是选择临床患者时，未考虑到患者病情发展阶段。

三、紧密连接的损坏与角质层屏障的互相影响作为AD发病的早期环节

角质层作为物理性屏障参与皮肤屏障功能，抵御外来伤害并阻止表皮的异常水分流失。TJ作为角质层下方的细胞旁屏障起作用。二者既构成完整的皮肤屏障，维持皮肤环境稳态，又能互相作用影响，参与AD的发生、发展。

有研究选用它莫西芬诱导的Cre重组酶构建Claudin-1基因敲除小鼠来观察TJ的形成情况。结果发现，注射它莫西芬4天后，在表皮的基底层和棘层就未见Claudin-1，在实验第8天，颗粒层也见不到Claudin-1，TJ就“漏洞百出”，然后朗格汉斯细胞(langerhans cell，LC)被激活，这时，并未见组织学上表皮有明显变化，也没有明显的水分流失，由此推测LC的激活是由于TJ的障碍。在实验的第18天，可以发现明显的表皮水分丢失，于是推测，TJ的障碍继发了角质层屏障功能障碍导致经皮水量丢失严重[14]。Sugawara等[15]通过基因敲除小鼠模型发现Claudin(-)小鼠通过角质层的水分蒸发要多于Claudin(+)小鼠，且Claudin(-)小鼠角质层脂质中的神经酰胺和丝聚合蛋白(filaggrin, FLG)表达水平在逐渐的降低。Yuki等[16]通过建立TJ损伤的等效模型，证实了TJ可能是通过影响角质层的PH来影响极性脂质和FLG的形成，从而阻碍了正常角质层屏障的形成。

AD患者中部分存在着FLG基因的突变，从而导致FLG合成受阻。Wang等[17]构建了FLG缺失的角质形成细胞系，发现FLG缺失后，角质形成细胞中ZO-1、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、Claudin-1和Occludin的蛋白表达量和基因表达量均降低，证明角质层屏障的缺失会引起TJ的异常。

大量研究发现，表皮屏障的相关基因与AD发病是有强相关性的，如FLG、Claudin-1等。早期研究发现，FLG基因缺失的AD患者的发病早于其他AD患者，并出现特应性的过敏症状，在成年后，患者AD症状持续时间更长。Brunner等[18]将儿童AD患者与成年AD患者的皮损进行基因分析发现，一些脂质屏障基因在儿童AD患者中显示优先下调，屏障受损可能是AD发生的早期改变。Hirano等[19]研究证明TJ的障碍可以导致皮肤炎症。被破坏的TJ进而引起角质层屏障的异常，导致大量经皮水分丢失，并帮助LC捕获更多的抗原、过敏原，促进过敏敏化，引发或加重AD炎症。另外，角质层屏障的受损有助于金黄色葡萄球菌的皮肤定植，加重炎性反应[20]。

总之，TJ和角质层屏障相互影响，破坏表皮屏障功能。屏障功能受损，促进微生物定植、免疫细胞的激活从而诱发、加重免疫炎性反应，反过来加重屏障功能受损，形成恶性循环。另有研究发现，早期润肤剂干预皮肤屏障可以延缓AD的发病，因此，认为表皮屏障受损是AD主要的早期发病环节[21]。

四、紧密连接与免疫系统相互影响，维持慢性炎症

TJ受到环境因素的影响，处于动态调节的过程中，它决定了离子、蛋白甚至是朗格汉斯细胞的转运模式。Yoshida等[22]通过实验结果表明，激活的LCs渗透了TJ来捕捉抗原。渗透了TJ的LCs的数量在有红斑损伤的AD患者的皮肤中升高了大约5倍，而在没有红斑损伤的AD患者表皮中和鱼鳞病、银屑病患者中并未发现渗透TJ的LCs明显增多。LCs的树突延伸穿透TJ特异性捕获抗原，刺激分泌相应因子促使Th2型免疫反应的发生，可推测，TJ的漏洞可以增加抗原的渗透，进而刺激DCs活化，放大炎性反应。

AD的特点是瘙痒、皮肤屏障破坏以及免疫系统的激活失衡，伴随Th2类细胞因子的参与。研究发现，AD患者的角质形成细胞中过度表达了白细胞介素-33(interleukin-33，IL-33)。另有研究证实，角质形成细胞特异性表达IL-33的转基因小鼠可以自发出现AD样皮损表现，表明IL-33可以促进AD的发展。既往研究表明，IL-33可以通过刺激表皮LCs在内的免疫细胞产生2型细胞因子，如IL-6、IL-13等参与AD的发病和病程进展。Ryu等[23]研究发现，过表达IL-33的AD小鼠表达Claudin-1的水平是降低的。体外实验发现，IL-33可以降低细胞的跨上皮电阻，并增加其对FITC-葡聚糖的通透性，提示对紧密连接功能的损伤；IL-33还可以降低FLG的表达，破坏角质层屏障功能，从而导致皮肤敏感易激惹，免疫系统的激活反过来又导致炎性因子的释放，从而形成恶性循环，维持皮损区的慢性炎性反应。

有研究在等效模型中探询Th2和Th17细胞因子对TJ蛋白表达的影响。皮肤取自AD模型小鼠的非损伤部位和损伤部位，结果显示在AD的非损伤部位，ZO-1的表达减少，在AD的损伤部位，ZO-1和Claudin-1的含量较正常减少，后续检测了IL-4、TNF-α、IL-17和IL-22对TJ的影响。其中结果显示，只有IL-17损伤了TJ，另外，在IL-17作用下丝聚合蛋白的表达减少。此实验中非损伤部位的蛋白表达情况和具体的机制需要更深入地研究，这里非损伤部位的TJ损伤与疾病的未来进展是否有相关性也需要进一步实验探讨[12]。

特应性皮炎患者多伴有哮喘、过敏性鼻炎等过敏性疾病，也被证实血清中IgE和组胺水平较正常人是升高的。有研究证实IgE和组胺也可对TJ产生影响。Roussel等[24]通过尘螨诱发IgE升高的过敏犬模型，检测犬表皮紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1的表达水平，发现IgE诱导减少Clauidn-1的表达水平，但是Occludin和ZO-1的表达水平不受影响。

Gschwandtner等[25]研究证实了组胺作用于人皮肤等价模型后，Claudin-1、Claudin-4、Occludin和桥粒蛋白明显减少并且伴随着生物素的渗透增加，说明组胺可以破坏皮肤的TJ的完整性。De Benedetto等[26]研究证实组胺通过H1R受体作用于角质形成细胞来抑制晚期分化，角质形成细胞的分化不全可能导致不完整的TJ网络。Glatzer等[27]研究证明组胺是通过T4R受体刺激角质形成细胞过度增殖的，这种过度增殖可能是导致分化不全和TJ的结构功能障碍的原因。相关研究证实了组胺释放对TJ的损伤，并表明这种损伤可能是通过影响角质形成细胞的增殖和分化导致的。

综上所述，TJ损伤可以帮助皮肤驻留的LC捕获外来抗原或变应原，引起体内的一系列免疫反应；而上述IL-33、TH2型细胞因子、IgE、组胺等因子又可以攻击TJ，从而形成恶型循环，维持皮损区炎症环境。

五、调节紧密连接是治疗AD的重要策略之一

AD多为慢性病程，迁延难愈，对患者的身心健康造成极大负担。而且临床中广泛用于AD治疗的皮质类固醇具有较大的不良反应，因此迫切需要替代治疗。前文发现TJ在AD发病中起着重要作用，尤其是在发病早期。因此，是否能通过调节TJ起到治疗疾病的作用是亟待深入研究的。

Yamada等[28]检查了在AD小鼠模型中局部应用大剂量葡萄糖对发炎皮肤的影响。结果发现AD模型中Claudin-1和FLG表达明显减少；低剂量葡萄糖局部使用后，Claudin-1和FLG的表达无明显变化，而使用大剂量葡萄糖后，可以增加Claudin-1和FLG水平。并且在体外IL-4、IL-13、胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)共同刺激HaCaT模型中，大剂量葡萄糖也可以诱导Claudin-1和FLG表达的增加。

Na等[29]研究了芦荟多糖对卵白蛋白(OVA)诱导的AD小鼠模型的干预作用，发现AD模型中ZO-1，Claudin-1和Claudin-8的基因表达水平明显降低，而口服芦荟多糖之后可以部分增加ZO-1，Claudin-1和Claudin-8的基因表达水平，缓解AD皮损表现。

Wang等[30]以FITC致敏并攻击小鼠以建立AD模型的初始阶段，检测升麻素对其干预作用。结果发现，升麻素减少了TSLP的表达，同时减少了上皮细胞之间的分离间隙并增加了TJ蛋白的表达。另外沉默Claudin-1基因时，升麻素对TSLP的影响显著降低。升麻素可以通过恢复TJ抑制了细胞因子，在疾病初始阶段抑制了过敏性炎症。因此，TJ可以作为治疗AD的作用靶点之一，且在AD早期，药物可以通过修复TJ减轻炎症及皮损表现。

综上所述，TJ在AD的发病中起到重要作用。TJ的功能障碍可以诱发角质层结构、功能障碍，引发炎性反应，从而加重病情；产生的炎性因子又可以通过调控紧密连接蛋白的表达来影响TJ的功能，形成恶性循环，导致疾病迁延不愈。越来越多的研究也发现调控TJ从而打破恶性循坏，是针对AD可行的治疗方法，本文旨在为以后临床治疗AD提供新的方向。