蜜蜂球囊菌基因结构优化及新基因鉴定研究

叶挺章

（广东省肇庆市畜牧良种示范推广中心 526040）

对于球囊菌的相关研究在近些年才逐渐推广起来，但是在研究的过程中，主要受到测序技术以及组装软件的制约，导致对其基因组信息的信息补充始终不够完整。 本文所采用的RNAseq 技术能够有效地利用高精度、高灵敏度的形式来对其进行测序等研究，并对其基因结构进行全面的优化。

1 材料和方法

1.1 供试球囊菌菌株

长期以来，所采用的球囊菌菌株，一直在某高校的密封保护实验室中所存储。

1.2 测序样品准备

首先需要对球囊菌进行活化处理，在操作上，首先需要将球囊菌菌株从实验室当中取出， 之后再将其接种到马铃薯的葡萄糖琼脂所制的培养基之上， 并将其放置在36℃的生化恒温箱当中，进行10d 左右的培养，观察培养基，直到出现了黑色孢子囊以及白色的菌丝。 这个时候将培养基转移到超净台当中，让其孢子囊以及产生的菌丝都转移到RNA-Free 的EP 试管当中，并马上进行液氮的冷冻降温，将其进行备用。 这样的操作便可以有效的对球囊菌当中已经注释的基因进行预测， 同时也能起到对新基因的检测。

1.3 基因结构优化

需要使用SOAP 软件， 对于还没有得到映射的核糖体当中的读段，将其映射到球囊菌的参考基因组之上，之后再利用Cufflink 来对其进行准确的读段，实现转录本的拼接，之后再将出现的重构结果，同已经得知的转录本序列进行详细的对比，但是在一部分的重构转录本之上，一些序列会有一定程度的延长，进而就会实现蜜蜂球囊菌当中， 对已经得到注释的基因结构进行全面的优化。

1.4 新基因的生物信息学预测

首先需要利用软件让重构转录本，同作为参考的基因组进行详细的比较，一般来说采用的是Cuffcompare 软件。 之后便可以在参考的基因组上对其位置进行分类。 其中，一旦在classcode当中出现了“u”，则可以表示为出现了新基因组。

1.5 新基因的RT-PCR 的相关验证

首先需要从实验室当中，取出一定量的进行超低温保存下的球囊菌菌丝以及孢子的试验样品， 之后再将其加入一定量的液氮，并进行充分的搅拌和研磨。 在此之后，需要利用RNA 抽提试剂盒对其研磨液的进行RNA 的提取，从而合成了cDNA 的首链。

2 结果与分析

2.1 RNA-seq 数据质控以及评估

本试验当中主要对其样品当中的有效读段， 同球囊菌当中的参考基因组进行一一的对比，在最后的结果上表明，其样品上的有效读段同作为参考的基因组占比一般为60%上下。 同时，在进行的测序饱和度的相关实验中， 其数据表明对样品的测序深度实验的不断增加， 使得其能够检测到的基因数越发的呈现饱和的趋势，这就表明该实验下，选取的测序深度能够对球囊菌基因进行全面的覆盖，从而表明选用的测序数据质量较为良好，可以进行下一步的分析[1]。

2.2 球囊菌基因结构优化

首先需将测序数据同球囊菌的基因组进行比较， 这样便可以对已经注释的基因当中的结构进行明确以及优化处理， 本实验当中已经对101 个球囊菌当中的已注释基因结构进行全面的优化处理，能够比较高效率的完成优化分析。

2.3 球囊菌新基因的GO 数据库注释

在实验当中，已经将球囊菌当中出现的84 个新基因组收入到了GO 数据库当中，这些新基因主要是对生物进程、细胞过程以及分子功能进行注释。 其数据库当中能够涉及到29 个左右的GO 条目，同时得到了最多的注释基因的领域，主要是关于代谢进程、催化活性等方面。

3 结论以及讨论

在采用了Sanger 双脱氧链末端的终止法，来对球囊菌进行了全面的基因组测序工作， 之后再使用软件来对其基因组进行全面的组装以及相关的注释操作， 这样便可以让其球囊菌当中的基因组的组装，满足scafford 的水平之上，同时对于N50 来说，也能够达到44 063 的bp。 但是由于在试验的过程中，还是会受到测序技术以及所使用的各种软件的影响， 使得容易出现对球囊菌基因组当中的各种功能注释不够全面的情况， 使得测序的质量性比较低，这样就会严重制约对球囊菌的研究和分析。 但是随着科学技术的发展， 使得在对于各种物种的基因进行基因组的测序实验分析越发的高效且准确，能够逐渐完善注释信息。 本试验当中成功的预测出了新基因的出现，其中有着67 个假定的蛋白编码基因，并且在进行功能注释信息的完善过程中，主要是依靠着分子的克隆，从而获取到基因的全长序列组，这样便可以完成对新基因以及其具体功能性的研究。

4 结语

综上所述，本实验当中，在对蜜蜂球囊菌基因结构的研究过程中，进一步确定和补充基因组序列，以及功能知识信息，使得其能够帮助相关研究人员实现对球囊菌基因组的分析和研究，并逐渐完善球囊菌的基因组序列， 对其基因功能进行注释信息的补充，促进了对新基因功能性的深入研究。