TGF-β1体外诱导兔子宫内膜上皮细胞EMT模型

姚 远，汪国武，张 雨，刘 芳

宫腔黏连(intrauterine adhesion,IUA)是子宫内膜损伤修复障碍最常见的疾病，其本质是子宫内膜纤维化修复，确切的发病机制至今尚不明确。近年研究证实，IUA的发生与上皮间质转化(epithelial mesenchymal，EMT)密切相关[1-2]。Thiery et al[3]提出2型EMT是大部分纤维化疾病的主要发病机制之一。TGF-β1是诱导EMT的重要因子之一，广泛用于体外诱导上皮细胞EMT[4-6]。项目组首次以兔子宫内膜上皮细胞为研究对象，通过CCK-8、免疫组化、Western blot等方法探讨TGF-β1诱导兔子宫内膜上皮细胞发生EMT的条件，为研究IUA的发病机制、预防及治疗等提供一定的细胞基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物10～12周龄雌性新西兰大白兔(体质量2.5～3.0 kg，清洁级)60只，购于新疆医科大学实验动物中心，购回后自由进食水适应性饲养一周，实验过程严格遵守动物伦理学标准。

1.2 主要试剂与仪器孕马血清促性腺激素(PMSG)购自北京Solarbio公司；绒毛膜促性激素(hCG)购自宁波市三生药业；DMEM/F12培养基、胎牛血清、表皮生长因子、胶原酶I、0.25%胰蛋白酶购自美国Sigma公司；Human TGF-β1购自美国PEPROTECH公司；Rabbit Anti-Cytokeratin 19 antibody、Rabbit anti-Vimentin antibody、Rabbit Anti-E cadherin antibody购自北京Bioss公司；即用型SABC-POD试剂盒购自武汉博士德生物公司。二氧化碳恒温培养箱(HF151，上海力新仪器有限公司)；生物安全柜(BHC-1300ⅡA2，北京阿尔泰实验室设备有限公司)；高端研究级倒置显微镜(Axio Observer A1，德国蔡司公司)；全光栅酶标仪(Multiskan GO，美国莫赛飞世尔公司)；双垂直电泳仪(DYCZ-24DN，北京六一仪器厂)。

1.3 细胞的培养给予兔肌肉注射PMSG 100 IU，48 h后耳缘静脉注射hCG 80 IU，18 h后耳缘静脉空气栓塞处死，取出子宫，含2%双抗PBS洗3次，纵向剪开子宫，用手术刀片背面轻刮内膜面至手感粗糙，DMEM/F12收集组织，用含0.05%胶原酶Ⅰ和0.05%胰蛋白酶的PBS重悬，37 ℃水浴锅中消化30 min。含10%胎牛血清DMEM/F12终止消化，150 nm滤网进行过滤，滤液使用38 nm细胞筛进行过滤，滤网上为兔子宫内膜上皮细胞，滤网下为兔子宫内膜间质细胞，DMEM/F12反复冲洗细胞筛，收集冲洗液1 200 r/min，离心6 min，弃上清液，使用上皮细胞培养基重悬，以1×106个/ml接种，置于37 ℃，5%CO2，95%湿度的培养箱培养。

1.4 细胞免疫组化鉴定4%多聚甲醛室温固定细胞30 min，0.3% Triton X-100浸泡5 min，蒸馏水洗2次，30% H2O2与纯甲醇1 ∶50混合，室温浸泡30 min，蒸馏水洗3次。5% BSA封闭，滴加一抗CK19(1 ∶200稀释)、VIM(1 ∶200)、E-cadherin(1 ∶200)，37 ℃孵育1 h，加入二抗孵育37 ℃，30 min，PBS洗2次，加入SABC 37 ℃，30 min，DAB显色2～10 min，苏木精轻度复染25 s，1% HCl酒精洗涤7～8 s，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，在倒置显微镜下观察结果。

1.5 CCK-8检测将对数生长期的细胞接种至96孔板中，待细胞融合至50%～60%，更换无血清的DMEM/F12培养基饥饿处理12 h后更换上皮细胞培养基，分别加入0、10、60、110 μg/L TGF-β1处理24 h和48 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液，孵育3 h后酶标仪测定450 nm下的OD值，实验重复3次取平均值。增殖抑制率(IR)%=[(OD值阴性对照组-OD值空白对照组)-(OD值实验组-OD值空白对照组)]/(OD值阴性对照组-OD值空白对照组)×100%。

1.6 Western blot检测提取总蛋白，应用BCA法检测蛋白浓度，分别取等量的蛋白质样本，进行SDS-PAGE凝胶电泳后，将蛋白转移至PVDF膜上，脱脂奶粉封闭，分别加入稀释的一抗VIM(1 ∶200)、E-cadherin(1 ∶200)，4 ℃过夜。TBST洗3次，再将PVDF膜放入10 ml二抗稀释液(1 ∶10 000)中，37 ℃温箱避光孵育1 h，TBST洗3次。加ECL发光剂，X线曝光、显影、定影。以GAPDH作为内参，通过Image J对比蛋白灰度值进行分析计算。

2 结果

2.1 兔子宫内膜上皮细胞培养及鉴定细胞在培养3 d后开始贴壁，细胞贴壁后增殖速度缓慢，约生长14 d后铺满瓶底，细胞呈近圆形，胞浆饱满，核位于细胞中央，排列紧密，呈铺路石样(图1 A)。对其骨架蛋白进行免疫细胞化学鉴定，结果显示：子宫内膜腺上皮细胞特异性细胞角蛋白-19(CK-19)染色呈现阳性，细胞质被染成棕黄色，核周胞质染色最强(图1 B)。

图1 兔子宫内膜上皮细胞培养及鉴定 ×200

A：P1代兔子宫内膜上皮细胞；B：P1代兔子宫内膜上皮细胞CK-19染色

2.2 TGF-β1对兔子宫内膜上皮细胞增殖的影响TGF-β1处理24、48 h，随着作用浓度增高，兔子宫内膜细胞增殖抑制率显著升高(F24 h=555.10，P<0.01；F48 h=17.00，P<0.01)，差异有统计学意义。与10 μg/L TGF-β1处理组比较，60、110 μg/L处理24 h及48 h后细胞增殖均受到显著抑制(P<0.05)，但60、110 μg/L浓度处理组间无显著差异(P>0.05)。对不同时间点同一浓度进行比较发现60、110 μg/L浓度TGF-β1处理组48 h后对细胞的抑制率均显著高于24 h(P<0.05)(表 1)。

表1 不同浓度TGF-β1对兔子宫内膜上皮细胞细胞增殖抑制率

与10 μg/L组比较：*P<0.05；与同浓度24 h组比较：△P<0.05

2.3 TGF-β1对兔子宫内膜上皮细胞形态的影响不同浓度TGF-β1诱导兔子宫内膜上皮细胞24 h及48 h后，倒置显微镜下观察细胞形态变化：结果如图2所示：在不同浓度及不同时间点的TGF-β1诱导下，子宫内膜上皮细胞均呈不同程度的拉长或出现丝状伪足，细胞拉长呈梭形，细胞边界模糊，细胞间隙增大，细胞密度降低。其中60 μg/L TGF-β1诱导24 h后，大多数细胞呈梭形(图2C)，细胞形态较正常培养组相比发生了明显的变化，向间质细胞样细胞形态转化；110 μg/L TGF-β1诱导48 h后，细胞呈典型的梭形，且细胞密度明显降低(图2H)。用不含TGF-β1的培养基继续培养上述细胞，观察到细胞形态保持稳定。

2.4 Western-blot法检测E-cadherin和VIM蛋白表达结果显示(图3)：TGF-β1处理24、48 h，随着作用浓度增高，E-cadherin蛋白相对表达量显著降低(F24 h=15.89，P<0.01；F48 h=224.6，P<0.01)，差异有统计学意义；VIM蛋白相对表达量显著升高(F24 h=27.77，P<0.01；F48 h=38.34，P<0.01)，差异有统计学意义。与对照组比较，10 μg/L TGF-β1诱导24 h及48 h E-cadherin和VIM蛋白的表达均无显著变化(P>0.05)；与对照组比较，60、110 μg/L TGF-β1诱导24 h及48 h均显著降低了E-cadherin蛋白表达量(P<0.05)，显著提高了VIM蛋白的表达量(P<0.05)；60 μg/L TGF-β1诱导48 h较24 h组E-cadherin蛋白和VIM蛋白的表达量差异均有统计学意义(P<0.05)；110 μg/L TGF-β1诱导48 h较24 h组VIM蛋白的表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5 免疫组化鉴定60 μg/L TGF-β1诱导内膜上皮细胞24 h免疫组化鉴定结果显示：E-cadherin蛋白实验组较对照组阳性细胞较少(图4A、4B)；VIM蛋白实验组较对照组阳性细胞较多(图4C、4D)。使用Image J计算相对阳性细胞面积：TGF-β1实验组E-cadherin蛋白表达(95.94±2.662)显著低于对照组(115.8±3.788),差异有统计学意义(P<0.05)，实验组VIM蛋白表达量(132.4±4.638)显著高于对照组(108.7±2.532),差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 TGF-β1对兔子宫内膜上皮细胞形态生物影响 ×100

A：正常培养24 h；B：10 μg/L TGF-β1剂量组诱导24 h；C：60 μg/L TGF-β1剂量组诱导24 h；D：110 μg/L TGF-β1剂量组诱导 24 h；E：正常培养48 h；F：10 μg/L TGF-β1剂量组诱导48 h；G：60 μg/L TGF-β1剂量组诱导48 h；H：110 μg/L TGF-β1剂量组诱导 48 h

图3 不同浓度TGF-β1及不同作用时间诱导子宫内膜上皮细胞蛋白表达变化

A：24 h E-cadherin、VIM蛋白表达量；B：48 h E-cadherin、VIM蛋白表达量；C：E-cadherin蛋白相对表达量；D：VIM蛋白相对表达量；1：对照组；2：10 μg/L TGF-β1诱导组；3：60 μg/L TGF-β1诱导组；4：110 μg/L TGF-β1诱导组；与对照组比较：*P<0.05；与同浓度24 h组比较：#P<0.05

图4 TGF-β1诱导兔子宫内膜上皮细胞24 h免疫组化 ×100

A：E-cadherim对照组；B：E-cadherim实验组；C：VIM对照组；D：VIM实验组

3 讨论

EMT的发生取决于细胞从其微环境获得信号，TGF-β1是一类涉及细胞增殖、凋亡、分化及EMT的调节因子[7]。在炎症或损伤等病理因素作用下，TGF-β1趋化成纤维细胞和炎性细胞聚集，同时促进胶原蛋白和纤维蛋白的合成，致使细胞外基质(ECM)沉积和降解紊乱，促进细胞转分化。研究显示，IUA子宫内膜及黏连组织[8]、血清[9]中TGF-β1表达较对照组均显著升高，且TGF-β1的表达与宫腔黏连程度呈正相关[10]，提示TGF-β1参与子宫内膜损伤纤维化修复，为TGF-β1诱导子宫内膜上皮EMT提供了一定的理论基础。

细胞增殖、分化、衰老、凋亡是多数细胞的发育结局，其可因微环境不同而相互影响，细胞的分化、凋亡、衰老会导致其本身增殖抑制，本研究发现60 μg/L TGF-β1诱导子宫内膜上皮细胞24 h即可抑制多数细胞增殖，促进其转分化。随着TGF-β1浓度和作用时间增加，子宫内膜上皮细胞EMT标志物E-cadhrien表达显著下调，表明TGF-β1是诱导EMT的有效因子。而VIM表达量呈增加趋势，与前期课题小组研究子宫内膜损伤后VIM蛋白表达增加结果一致[11]。综上，子宫内膜上皮细胞通过TGF-β1诱导后，其形态向间质细胞转变，主动转移潜能增加而细胞间黏附性降低，失去极性，发生了表型转化，成功诱导子宫内膜上皮细胞发生EMT。EMT与子宫内膜纤维化疾病相关的研究很少见，直至近年才有学者陆续提出EMT可能是IUA的发病机制之一[2-3]，建立子宫内膜上皮细胞EMT模型或可为研究IUA发病机制及治疗提供依据。

EMT是纤维化疾病中至关重要的过程，应用EMT特异性抑制剂，阻碍EMT过程，已成为靶向治疗纤维化疾病的新策略[12-13]，TGF-β1诱导兔子宫内膜上皮细胞EMT为研究宫腔黏连等子宫内膜纤维化修复疾病的发病机制、预防及治疗提供了一定的细胞基础。综上所述，使用60 μg/L的TGF-β1诱导兔子宫内膜上皮细胞24 h可成功建立EMT模型，但还需要进一步研究建立子宫内膜细胞EMT更加细致的条件及TGF-β1诱导兔子宫内膜上皮细胞EMT的具体机制。