高毒力肺炎克雷伯菌分子致病机制研究进展*

张 颖，李 轶 综述，郭 思,2△ 审校

1.河南大学人民医院/河南省人民医院检验科,河南郑州 450003;2.华中阜外医院检验科,河南郑州 450003

1882年，肺炎克雷伯菌(KP)首次从死于肺炎的患者的肺中被分离出来[1]。 KP属于肠杆菌科，是人类胃肠道菌群的一部分。它们携带多种毒力基因，并且具有获得抗菌药物抗性基因的能力，同时可以引起局部和播散性感染[2],是临床常见的条件致病菌之一。大多数“经典”肺炎克雷伯菌(cKP)能够引起肺炎、尿路感染、腹腔感染、血管内装置感染、手术部位感染、软组织感染、菌血症等，常发生于住院需长期护理或免疫功能低下的患者，一般常规用β-内酰胺类和其他有效对抗肠杆菌科的抗菌药物进行治疗[3]。临床变异的高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP)在过去20年中逐渐出现[4]。与cKP不同，hvKP所致感染常发生在健康的流动性人群中，通常引起社区获得性感染，并伴有远处转移或扩散，严重者可危及生命。除此之外，hvKP感染的肝脓肿患者通常无肝胆病史[5]。目前，尚无统一标准定义hvKP，对hvKP的鉴定大部分通过拉丝试验，在琼脂平板上培养的菌落过夜后，用接种环轻触菌落，若有黏液丝且拉丝长度>5 mm，即可初步判断为hvKP。hvKP的高黏性特征与其毒力有密切的关系，因而被认为是鉴定hvKP的有效指标。但是也有研究发现不是所有的hvKP菌株都表现为高黏性特征[5]。控制细菌荚膜多糖(cps)合成的基因可在不同菌株间通过水平传递的方式转移，使不具备hvKP特征的菌株也表现出高黏性特征，这使得hvKP与细菌菌落高黏性特征间的相关性大大降低。因此，不能仅凭高黏性特征和血清型鉴定hvKP，而应明确菌株的表型和基因型特性是否符合hvKP的特性以鉴定菌株的毒力[6]。本研究就hvKP的毒力相关因子及分子致病机制进行了综述。

1 hvKP的毒力相关因子

hvKP的高毒力与多种毒力因子密切相关，例如铁载体、荚膜血清型、菌毛等。其中cps的合成增加与摄取铁能力的增强共同组成hvKP毒力增强的主要因素[7]。

1.1铁载体 铁是一种对细菌生长至关重要的元素，获取铁的能力对细菌的生长和复制尤为重要。这种特性在感染过程中起着至关重要的作用[1]。KP必须从宿主获取铁，以便在哺乳动物感染期间存活和繁殖。许多病原体(包括KP)获取铁的主要方法是通过铁载体的分泌，铁载体比宿主转运蛋白对铁有更高的亲和力，可以从宿主铁螯合蛋白中获取铁元素或从环境中清除铁[8-9]。另外，铁载体的分泌也诱导炎症和细菌传播。KP可分泌多种类型的铁载体，包括气杆菌素、肠杆菌素、沙门菌素和耶尔森杆菌素。不同铁载体的产生可以使KP定植并传播到宿主内的不同位点，在加入人类腹水的培养基或贫铁的基本培养基上培养 hvKP和cKP，通过铁载体定量试验(CAS检测法)测得hvKP可分泌数量更多、活性更强的铁载体，这可能是KP毒力增强的重要机制之一[7]。研究还发现hvKP菌株的铁载体活性为cKP菌株的6～10倍[7]。肠杆菌素在cKP和hvKP菌株中几乎无处不在，被认为是KP的主要铁摄取系统，相比之下，耶尔森杆菌素、沙门菌素和气杆菌素的表达水平在hvKP中比在cKP中高得多[8]。RUSSO等[10]通过使野生型hvKP(hvKP1)基因位点突变，发现无论是在体内及体外培养都不能单独合成沙门菌素、耶尔森杆菌素、肠杆菌素，都不能使hvKP的毒力减低，而不能合成气杆菌素的菌株毒力会明显下降，因此气杆菌素被认为是hvKP最重要的铁载体，也是其重要的毒力因子。目前气杆菌素的水平在hvKP中明显增多的机制尚不清楚，但已经确定的是，在铁缺乏的条件下，hvKP铁载体总含量得以增加的主要原因是气杆菌素的存在[11]。另外，耶尔森杆菌素的分泌和利用也与患者的呼吸道感染有关，hvKP强大的铁摄取系统使得细菌在缺乏铁的情况下也能保证足够的铁来源。

1.2cps

1.2.1荚膜 临床资料表明，具有高黏性特征的KP菌株更易引起一些特殊的侵袭性感染，例如肝脓肿、脑膜炎、脓胸、眼内炎等，高黏性特征在这些菌株引起感染的过程中可能发挥了重要作用[6]。hvKP的高黏液性和高毒力特征与其增厚的荚膜有关。荚膜是一种包裹细菌的细胞外多糖基质，是细菌的一种特殊结构。荚膜的结构与细菌的黏附、抗血清杀菌、抗吞噬和远处定植的特性密切相关[12]。hvKP菌落黏稠的性状正是cps合成旺盛的直接表现。cps由位于染色体上的cps基因簇编码,cps基因簇全长21～30 kb，包括16～25个基因。cps基因簇中wzi、wza、wzb、wzc、gnd、wca、cpsB、cpsG、galF与cps合成相关，wzy(orf4)、cpsB、cpsG与cps聚合相关，wza、wzc、orf5、orf6与装配相关,wzi编码荚膜黏附相关的表面蛋白[13]。有研究者用分离自患肝脓肿小鼠的KP制成一系列浓度梯度的菌液，注入小鼠体内，以半数致死量(LD50)评估菌株的毒力，结果显示K1型野生型菌株LD50(<10 CFU)远小于不产荚膜的K1型突变株LD50(>1×106CFU)，以此证实了cps的毒力作用[14]。

1.2.2血清型 根据cps的不同，KP被分为82种血清型[15]，hvKP菌株由于扩增荚膜物质的产生，产生更加坚固的荚膜，其中K1和K2血清型与细菌的高毒力密切相关，是导致临床细菌性肝脓肿的主要致病菌。K1型常继发于远处转移。最近有研究表明K1、K2、K5、K6、K20、K54、K57及新发现的 KN1血清型与hvKP有关[12]。LIU等[16]对北京朝阳医院2008-2012年检测出的hvKP进行PCR及多位点基因分析，发现hvKP荚膜分型中常见的是K1、K2、K20和K57，并且hvKP阳性患者更易发生社区获得性感染，且多集中于K1及K2型。有研究对2013-2014年北京3家教学医院肝脓肿病例进行回顾性研究，发现引起肝脓肿的hvKP以K1型为主(53.9%)，其次为K2型(32.2%)[13]。那么，为什么K1和K2血清型在hvKP中如此普遍？主要有以下几个原因：(1)K1和K2菌株缺乏被宿主因子识别的特定甘露糖残基重复序列，例如巨噬细胞上的甘露糖结合受体和肺分泌的表面活性蛋白A(SP-A)；(2)K1和K2菌株表面具有宿主特异性单糖唾液酸，可模拟宿主细胞，从而可逃避宿主免疫细胞；(3)与其他血清型菌株相比，K1和K2菌株可诱导嗜中性粒细胞释放更小的活性氧物质，从而可以更好地存活于人体组织中；(4)与具有其他K血清型的菌株相比，K1和K2菌株具有更多样的O血清型，其可以帮助K1和K2菌株逃避宿主免疫系统。K1及K2型荚膜最初被认为是hvKP的主要毒力因子，也被定义为hvKP最初的主要特征。但是，并非所有的hvKP引起的社区获得性肝脓肿都是K1及K2型，在非社区性获得性肝脓肿的小鼠模型中也检测出K1、K2型，并且表现出较低的毒性[10]。TAN等[17]对129株分离出的hvKP进行PCR测定，发现超过一半和肝脓肿有关的血清型不是K1及K2型。所以，hvKP的毒力强弱并非仅仅是K1、K2荚膜血清型分型导致的，可能与其毒力基因有关。

1.2.3高黏性表型 参与调控胞外cps合成的主要荚膜转录激活因子有RmpA及RmpA2。目前认为位于染色体上的c-rmpA基因和质粒上的p-rmpA、p-rmpA2基因在hvKP中参与编码RmpA、RmpA2[18]。

RmpA可激活荚膜产生，导致高黏液表型和毒力增加。在KPCG43中，p-rmpA和p-rmpA2均有助于增加荚膜产生，而在NTUH-K2044(ST23、K1血清型)中，第一个基因组测序的hvKP，只有p-rmpA促成荚膜基因表达的增加。因此，说明每种RmpA在超毒力中的作用也是十分必要的。最近，吴桂立[19]在临沂地区hvKP的分子致病机制研究中发现，69株KP中具有高黏液表型的hvKP为37株，其中收集的 hvKP 菌株全部表达RmpA，因此，RmpA可以作为实验室诊断hvKP的辅助参考指标。此外，有研究表明，RmpA以RcsB依赖性方式激活cps表达，并且其DNA结合基因序列是发挥调节作用所必需的[20]。

黏液相关基因A(magA)于2004年被发现，magA存在于Kl型KP的cps体生物合成区内，被认为与细菌高黏性、血清抵抗及细胞吞噬抗性有关，作为KP cps聚合酶wzy负责K抗原的合成，现将magA重命名为wzykDk。台湾的一项研究显示，83%来自化脓性肝脓肿患者的KP菌株为magA阳性，从其他侵袭性感染患者中分离的菌株中只有3%为magA阳性[15]。但是，最近有研究发现，许多高黏性KP菌株并未检测出magA基因，一些表达magA的菌株也并未表现出高黏性特征，表明magA基因与高黏性特征两者之间可能并没有特定的联系[6]。在对77株已明确血清型的KP菌株的研究中发现，magA仅存在于K1血清型的菌株中，因此，认为magA基因是编码K1血清型菌株cps的主要基因，而非特定的毒力基因，即magA基因是一个编码KP的荚膜血清型而非高黏性特征的cps基因[6]，在K1血清型KP中是重要的毒力因子，与其致病性有很大的联系。

1.3菌毛 细菌黏附于宿主细胞表面是其进展至感染的关键步骤之一，在KP中，这通常通过菌毛来实现[3]。目前，已知两种类型的菌毛存在于KP中，即1型和3型菌毛。虽然已知3型菌毛能与气管上皮细胞、肾小管细胞等不同人类细胞结合，但1型菌毛似乎更具有特异性。另外，KP菌株产生生物膜的能力增强导致KP对宿主防御因子和抗微生物剂的抗性增加，并且生物膜越来越多地被认为是重要的毒力因子。影响生物膜形成的因素有很多，如荚膜、菌毛、数量感知系统等，其中菌毛在生物膜的形成过程中起到至关重要的作用[21]。而1型和3型菌毛也与KP中的生物膜形成有关(3型菌毛比1型菌毛作用更强)[22]。hvKP比cKP产生更多的生物膜，这可能也是其毒力增强的原因之一。

1.4序列类型 序列分型是用于菌株分类的分子流行病学方法，并且已经用于KP的分型筛选[1]。hvKP菌株具有特定的MLST序列型别，如ST23与Kl荚膜血清型和肝脓肿密切相关，另外，ST57与K1型相关，ST86、ST375、ST380与K2型相关。常见的cKP序列分型为ST11、ST15、ST65和ST258，另外，K1/ST23更可能含有与高黏液表型和铁摄取相关的毒力基因，与这些毒力基因共同促成hvKP的发病机制。与K1血清型相比，K2和其他血清型在ST方面遗传多样性差异更大，并且获得毒力基因(kfu、irp、iuc、iro、rmpA)的可能性较小[2]。虽然hvKP的序列分型与其高毒力及致病性没有直接的关系，但是对可能引起感染流行的hvKP进行序列分型有助于早期干预[23]。

2 hvKP的定植与感染

hvKP的定植是获得内源性感染的第一步，但是hvKP定植感染发病率及感染机制并不明确。hvKP在胃肠道、口咽、皮肤均可定植，但是胃肠道是定植的主要部位。细菌进入到肠道以外的组织或器官以继续生长是整个感染的重要步骤，cKP和其他肠杆菌科感染的途径包括从会阴部进入膀胱，破坏肠道使细菌进入腹膜腔，口咽部定植进入呼吸道，以及破坏皮肤屏障等。虽然hvKP进入机体的途径并不明确，但是可以明确的是hvKP感染通常发生在宿主抵抗力无明显缺陷的患者中。而且，hvKP进入宿主体内并不一定会引起感染，细菌还需要应对宿主的抵抗力并在宿主体内存活。研究表明hvKP菌株的存活能力明显高于cKP菌株[24]。hvKP可以导致化脓性肝脓肿、脾脓肿、自发性细菌性腹膜炎、肺炎、眼内炎、脑膜炎、尿路感染等。另外，糖尿病、恶性肿瘤、肺炎、肾脏疾病被认为是hvKP感染的高危因素。此外，hvKP感染导致的化脓性肝脓肿通常发生在无肝胆病史的人群中，定植在肠道的细菌通过侵犯肠黏膜进入门静脉，继而到达肝脏引起感染。通过对hvKP感染的小鼠模型的研究已经证实hvKP可以穿过肠黏膜屏障导致肝脓肿。此外,吞噬了hvKP的中性粒细胞通过血液循环可将hvKP带至机体的多个部位,导致皮下组织、肺、肝形成脓肿[5]。另外，hvKP感染存在一定的区域易感性，在亚洲人群中高发，这可能与宿主基因易感性或不同地域病原体暴露水平不同有关。

3 小 结

目前对hvKP的研究有限，铁载体、荚膜血清型、高黏液表型、菌毛等被认为是hvKP的高毒力因子，并与其致病能力有关。但目前对其分子致病机制尚无法完全阐明，hvKP进入机体的途径及发生转移性播散的机制仍需要进一步研究，转移性感染为何易发生于糖尿病患者，亚裔群体中hvKP为何具有较高的肠道携带率，其与免疫系统是如何相互作用，这些问题都亟待解决。但是，目前国内对hvKP的研究还主要集中于hvKP的耐药性。临床工作者必须提高对hvKP的认识，深入研究hvKP的致病机制对于正确认识hvKP所致感染,降低hvKP的危害具有重要意义[25]。