肺炎克雷伯菌毒力因子研究进展

宋国滨，徐元宏

(安徽医科大学第一附属医院检验科,安徽 合肥 230022)

肺炎克雷伯菌是肠杆菌科家族中的一员，可以引起严重的器官和生命危险性疾病，在临床上是一种越来越重要的细菌病原体，因一直处于不断进化中导致具有一个关键特性即容易获得新的遗传物质的能力[1]。也正是由于这种能力的存在产生了两种变异体，分别是经典型肺炎克雷伯菌(classical K. pneumoniae， cKp)和高毒力肺炎克雷伯菌, 每一种都对临床医生提出了严峻的挑战[2-3]。

随着目前临床上侵入性操作越来越多(气管插管、静脉留置导管、外科手术等)，患者的感染发生率也在不断上升，引起院内感染的肺炎克雷伯菌大部分是cKP，这种病原体已经被证明可以快速传播产生对抗生素的耐药性，这使得cKP在屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌病原体中占有一席之地，给临床抗感染治疗带来了压力。

与cKP相比，对HvKP的研究不多，自1983年我国台湾分离并报道的第一例高毒力肺炎克雷伯菌目前在全球范围内广泛传播开来，主要引起社区获得性感染，其感染对象可以是任何年龄的健康人，并易向远处转移，引起远处部位的感染(肝脓肿、眼内炎、中枢神经系统炎症，腹膜炎等)[4]。最初研究者以菌落呈现高黏液性作为筛选HvKP的标志，但是后来的研究证实并非所有的HvKP都表现出该特性，一些cKP也可以表现出高黏液表型[5-6]。然而需要注意的是一些研究证实通过毒力基因可能使检出率更加准确，其含有的毒力基因众多，包括荚膜多糖以及促荚膜多糖合成基因(rmpA/ rmpA2基因、MagA基因)、铁载体系统(肠杆菌素、耶尔森菌素、气杆菌素、沙门菌素)、菌毛粘附蛋白(Ⅰ型菌毛、Ⅲ型菌毛)，故在下面详细介绍以上几种毒力因子。

1 荚膜多糖及促荚膜多糖合成基因

1.1荚膜多糖：肺炎克雷伯菌的荚膜多糖是一种酸性多糖，通常由3～6个糖的重复单位组成，是由Wzy依赖的聚合反应途径合成的[7]。合成荚膜多糖的基因簇大小在21-30kb之间，约有16～25个相关基因[8-9]。所有已知的肺炎克雷伯菌cps基因簇的5′端区域包含6个保守基因(按以下顺序排列：galF、orf2、wzi、wza、wzb和wzc)，3′端区域包含1个保守基因gnd，主要终止于ugd基因，而中心区域则包含1个保守基因gnd，编码cps亚单位聚合和组装的蛋白质是高度分化的。wzy和wzi基因存在于所有的K型中，但它们在不同的K型中都具有高度的序列变异性。

因此，建立了wzy靶向PCR方法鉴定K1、K2、K3、K5、K20、K54和K57[10]，并且wzi测序能够区分大多数临床肺炎克雷伯菌分离株的K型。此外，基于wzc测序的荚膜分型方法已被用于检测新型肺炎克雷伯菌荚膜类型。荚膜多糖是构成肺炎克雷伯菌荚膜的重要组成成分，也是其毒力强的一个主要因素，主要是可以保护肺炎克雷伯菌免受巨噬细胞、中性粒细胞、上皮细胞和树突状细胞(DC)的调理和吞噬，抵抗机体免疫细胞对其的杀伤作用，逃避免疫系统对其的识别；另外被中性粒细胞吞噬后在细胞内不被分解，借助细胞向远处进行转移，引起远处部位的感染[11]。由于有这层屏障的存在，抗菌药物也无法有效地起到杀菌作用，因此是毒力增强的主要因素。

1.2荚膜多糖调节基因：RmpA/RmpA2基因：质粒携带的RmpA及RmpA2基因编码促进荚膜多糖合成的转录激活因子，可以使K1、K2血清型的肺炎克雷伯菌的荚膜多糖快速大量的合成[12-13]，使菌落呈现高黏液表型。除了质粒上能够携带RmpA及RmpA2基因外，细菌的染色体上也可以携带，但是只有质粒上携带的两种基因才可以增强荚膜多糖的转录过程。

MagA基因：荚膜多糖的合成起始于单个糖重复单元的组装，这些糖单元由不同的糖基转移酶按顺序进行催化。由此产生的新生重复序列通过flippase Wzx转移到内膜上，并在周质空间通过Wzy聚合酶进行聚合，在Wza(一种内膜酪氨酸自身激酶)、Wzb(一种蛋白酪氨酸磷酸酶)和Wzc(一种完整的外膜脂蛋白)的联合作用下进一步聚合控制和向细菌细胞表面输出成熟的CPS。magA基因编码荚膜血清型K1特异性Wzy聚合酶，但在脂多糖(LPS)合成中不起作用[14-16]，只存在于K1血清型的菌株中。有研究表明当magA基因发生突变后，荚膜多糖的合成量大幅下降，菌株的毒力作用也显著降低。

2 脂多糖

脂多糖存在于革兰阴性菌细胞壁中，是细胞壁外壁的组成成分，主要由多糖和脂质构成，同时也是一种可以引起人体发热的内毒素。O抗原是脂多糖最外层的一种成分，可以保护细菌免于机体的补体系统对其的杀伤作用，但是与细菌逃避中性粒细胞作用无关。与大肠杆菌和肠沙门氏菌相比，与LPS相关的肺炎克雷伯菌O抗原的分析受到限制。目前为止已经描述了9种O抗原类型[17]，其中O1型是与人类感染相关的最常见血清群。抗原特异性可能是由于单重复亚基修饰的作用，例如O2a血清型的O抗原侧链是双糖D-半乳糖亚基的聚合物。因此，可知肺炎克雷伯菌的脂多糖和荚膜并不是完全独立产生的，其中一种结构的形成会影响另一种结构的数量和存在。已在K2血清型中研究了胶囊与脂多糖的关联，其中荚膜通过GalA[18]上羧基的负电荷与LPS的离子相互作用而结合。有报道称，在LPS生物合成中起重要作用的酶会影响肺炎克雷伯菌细胞结合膜的数量。这些结果表明了克雷伯菌这两种结构在生化和合成水平上的相互关系。

3 铁载体系统

因为铁是细菌代谢所必需的辅助因子，肺炎克雷伯菌必须在体内与宿主细胞竞争必需的铁来完成生命活动。细菌病原体通过合成被称为铁载体的小的铁清除分子来应对哺乳动物宿主体内铁的缺乏(其中铁被各种铁结合蛋白结合)，包括肺炎克雷伯菌在内的肠杆菌科病原体产生一种称为肠杆菌素(enterobactin)的典型铁载体，与任何其他已知的铁螯合剂相比它具有最高的铁亲和力。此外还有气杆菌素(aerobactin)、耶尔森菌素(yersiniabactin)和沙门菌素(salmochelin)[19]。

气杆菌素是由柠檬酸分子与N6-羟基乙酰赖氨酸组成的羟肟化合物，由赖氨酸氧化衍生而成[20-21]。耶尔森菌素是一种酚型的铁载体，而沙门菌素是一种糖基化的肠杆菌素。除了所描述的4种铁载体外，高毒力肺炎克雷伯菌可能还具有其他多种铁捕获系统。以铁载体为基础的铁获取途径，允许这种病原体逃避宿主固有免疫的脂蛋白2机制[22]，有文献报道，曾分离出一种高毒力高黏液性肺炎克雷伯菌，对该菌的毒力基因研究发现，其产生一种大小约3kd左右的小分子物质，使菌株可以在腹水中生长和存活。初步证据表明，该分子与铁的吸收有关，是一个铁载体。研究表明，与毒性较小的肺炎克雷伯菌相比，这些菌株的毒力增强可能部分是由于铁载体产生增加以及铁结合活性增加所致[23]。最近的数据表明，HvKP菌株比经典型肺炎克雷伯菌菌株具有产生更多和生物活性更高的铁捕获分子的能力，这一机制可能有助于毒力和发病机制[24],揭示了高毒力肺炎克雷伯菌增加其致病潜能的额外机制，除了铁载体参与摄取铁离子外，还存在介导铁离子进入细菌体内的基因，如tonB基因和kfu基因。由气杆菌素和沙门菌素携带的铁离子，需要与tonB基因编码存在细胞膜上的疏水端结合才可以进入细胞，kfu基因编码的蛋白能够介导铁离子的转运并调节细菌的毒力。之前的研究表明，kfu基因只存在于荚膜血清型为K1的菌株，但后来的研究表明该基因也可存在于K2血清型的一少部分[25]。

4 菌毛黏附蛋白

肺炎克雷伯菌具有Ⅰ型和Ⅲ型菌毛黏附蛋白，菌毛黏附蛋白有助于细菌黏附人体的上皮细胞和免疫细胞以及非生物表面，是细菌感染机体的首要前提。Ⅰ型菌毛主要参与细胞内细菌群落的形成，Ⅲ型菌毛对于生物和非生物表面的生物膜形成具有重要性。高毒力肺炎克雷伯菌和经典型肺炎克雷伯菌都含有这两种菌毛黏附基因，在cKP菌株中菌毛蛋白已被证明可以与来自呼吸道和尿道的宿主上皮细胞黏附以此来增加感染[26-27]。尽管对HvKP的研究很少，但一项研究报道了HvKP菌株CG43中Ⅲ型菌毛基因的调节，该研究证实了Ⅲ型菌毛蛋白参与了生物膜的形成，并证明了其表达与铁浓度呈正相关，尽管体内毒力没有被提及，但这些数据表明在游离铁有限的人类宿主体内Ⅲ型菌毛黏附蛋白起到的作用有限[28]。此外，Lin等的研究表明肺炎克雷伯菌在高浓度的葡萄糖作用下会通过抑制CRP-cAMP的机制促使Ⅲ型菌毛黏附相关基因的表达[29]，因此糖尿病患者更容易被肺炎克雷伯菌引起肝脓肿，可能与此机制有关。

5 总结和展望

肺炎克雷伯菌是一种机会致病性病原体，荚膜多糖的大量合成是毒力增强的重要因素，其他毒力因子包括促荚膜合成基因、铁载体、菌毛黏附蛋白等。除了毒力因子之外，很多地区都检测出携带耐药质粒的高毒力肺炎克雷伯菌[30-31]，这种细菌毒力高，耐药性强，在临床工作中应引起重视。

尽管已使用全球性筛选方法(如标记突变基因法)来确定候选毒力的方法，但是当前对肺炎克雷伯氏菌发病机理的了解主要来自研究单个基因， 在不同类型的肺炎克雷伯菌中可以发现巨大的遗传变异性，这可能导致致病性的巨大差异。目前仍然尚不清楚对控制复杂细胞途径以协调方式运行的调节网络的理解，这使得哺乳动物宿主中的肺炎克雷伯氏菌成为可能。基因组学和转录组学研究有望从基因组规模的角度为我们提供对肺炎克雷伯菌-宿主相互作用的更深入了解，并为进一步基于假设的功能表征鉴定毒力相关基因的众多候选基因。