人源肿瘤异种移植模型在上皮性卵巢癌研究中的应用进展

杨 雯，孟元光

解放军总医院第一医学中心 妇产科，北京 100853

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是卵巢癌中最常见的类型，包括有相似临床特征和行为的上皮性卵巢癌、输卵管癌及原发性腹膜癌。EOC的标准治疗方案为肿瘤细胞减灭术后采用以铂类药物为基础的一线方案辅助化疗[1]。随着研究的进展，EOC患者的生存状况得到了一定的改善，但是总体临床治疗效果并不理想，5年生存率仅有30% ～ 46%。EOC治疗难点在于患者对铂类药物化疗耐药[2-3]。为了解决这一问题，许多研究人员开始尝试采用人源肿瘤异种移植(patientderived xenograft，PDX)模型进行相关药效学及肿瘤发生及转移机制的研究[4-6]。

1 PDX模型概述

PDX模型是以患者手术切除或活检的新鲜肿瘤组织，植入5 ～ 8周龄免疫缺陷小鼠体内，使肿瘤在动物体内生长，进而进行相关体内实验的动物模型[5]。最早的PDX模型为1969年建立的结肠肿瘤人源肿瘤异种移植模型。在PDX模型建立前，肿瘤药物的研究采用细胞系肿瘤异种移植(cell line-derived xenograft，CDX)模型。CDX模型是将人体肿瘤细胞系移植入动物体内建立的，CDX模型的优点为建立容易、重复性好、细胞体外长期传代、呈现高度同源性。但CDX模型也存在一定缺陷，相对于建系的瘤株，人体原发肿瘤的所有细胞亚群并不能全部出现在移植瘤中，且肿瘤组织的间质中存在免疫缺陷动物的成分。因此CDX模型的生物学特性与真正人类肿瘤的特性存在较大差异[6]。而PDX模型采用整块的新鲜组织，能够保留肿瘤组织的异质性，保留人源性的基质细胞、血管组织及细胞因子，维持肿瘤组织的微环境不变，且研究表明PDX模型与肿瘤基因组图谱文库中患者的基因表达亦呈现较高的一致性[7]。因此PDX模型是上皮性卵巢癌药物筛选、生物标志物鉴定、临床前药物评价和生物学机制研究比较理想的模型[8-9]。

2 上皮性卵巢癌PDX模型(EOC PDX)的建立

自1993年Fu和Hoffman[10]成功建立了首个卵巢癌PDX模型以来，目前已有数个关于卵巢癌PDX模型特征及应用的研究[11]。各个研究中建模的方法存在一定差异。在不同的研究中采用的免疫缺陷小鼠基本有以下几种：1)裸小鼠(Nude)，由于先天性无胸腺，因此缺乏的免疫细胞为T细胞；2)重度联合免疫缺陷小鼠(SCID)，T细胞及B细胞缺陷；3)基因敲除小鼠如NSG、NCG、NOG小鼠等，这类是免疫缺陷程度最高的工具小鼠，此类小鼠缺乏T细胞、B细胞及NK细胞，且有溶血补体缺陷、巨噬细胞缺陷和树突状细胞缺陷。

目前报道的卵巢癌PDX建模方法有卵巢原位移植、腹腔种植、皮下移植及肾包膜下移植等。由于不同移植位置受到激素影响不同，在卵巢及腹腔移植的肿瘤表型与非原位移植(皮下/肾包膜下)存在一定差异。2014年Ricci等[12]采用NCrnu/nu小鼠和138例患者肿瘤标本成功建立了34例EOC PDX模型，其中22例皮下移植，12例采用腹水肿瘤细胞进行腹腔移植，其中1例患者样本同时进行了卵巢原位移植。结果发现皮下和腹腔内移植的模型在生长率上表现出显著差异(分别为1 ～ 15个月和1 ～ 4个月)。同时发现卵巢原位移植的PDX模型与腹水腹腔种植模型的肿瘤腹腔播散程度类似，而且用肿瘤腹水细胞建立的模型会产生腹水，但用实体瘤建立的模型并不产生腹水。2017年Heo等[13]应用BALB/C-nude 小鼠采用肾包膜下植入的方法建立EOC PDX模型，建模成功率48.8%(22/45)。该研究认为肾包膜下建模也是一种可行的方法。首次Fu和Hoffman[10]报道的EOC PDX模型的建模成功率为40%左右，目前建模成功率较高的为2014年Topp等[14]报道的应用NSG小鼠建立的EOC PDX模型，成功率为83%(10/12)。为了保证建模成功，该研究同时采用了皮下及卵巢原位注射两种方法。影响建模成功率最主要的因素为肿瘤类型而并非移植部位，高级别浆液性癌的成功率高于黏液性癌。皮下移植的优点是肿瘤表型稳定，且体表肿瘤大小易于观察，测量更准确[15]。

3 PDX模型组织病理学特点与原发肿瘤一致

在组织学方面，几乎所有的PDX相关研究均证实PDX模型的组织病理学特征与原发肿瘤基本保持一致[12-13,16-20]。Colombo等[17]采用77例卵巢癌患者的新鲜肿瘤组织移植到裸鼠皮下建立PDX模型，35例造模成功。结果显示，原发肿瘤不同级别的浆液性癌、黏液性癌及透明细胞癌、癌肉瘤(苗勒氏管混合瘤)都在PDX模型中得到表现。尤其是癌肉瘤的模型，忠实地复制了原代肿瘤特征。一般情况下，癌肉瘤在复发和转移时往往肉瘤会占据癌的成分，但在PDX模型上，癌和肉瘤两种成分都得到了体现。Liu等[18]建立了14例EOC PDX，发现所有PDX模型的免疫组化均显示CK阳性，这证实了模型的上皮性起源。此外，大多数模型的肿瘤组织中PA8和WT1的表达与上皮性卵巢癌一致。其中一个有代表性的模型，多个特征性免疫组化结果与原发肿瘤均一致，包括PAX8、P53、CK7和Ki-67，这表明模型与原始患者样本保持了组织学上的一致性。

4 EOC PDX模型分子特征

已有研究证实PDX模型与肿瘤基因组图谱文库中的多种实体瘤的基因特征表达有较高的一致性，其中包括上皮性卵巢癌[7]。Ricci等[12]采用基因芯片的方法，得出二者有73%(18/23)一致性，模型与患者的MET、MY、PI3Kα、PTEN、FGFR1、ERBB2、NF1和RB1基因分布情况类似。Liu等[18]对14例PDX模型通过微阵列比较基因组杂交、目标全外显子测序分析后，发现模型在特定基因的改变和激活PI3K信号转导通路上都表现出遗传多样性。Li等[19]成功建立了3个化疗耐药和4个化疗敏感的卵巢高级别浆液性癌的PDX肿瘤模型。对PDX的RNA序列分析显示，化疗耐药组与化疗敏感组相比，146个基因表达明显上调，54个基因表达下调。全外显子测序分析显示，39个突变位点仅出现在化疗耐药组。SAP25、HLA-DPA1、AKT3和PIK3R5基因的差异表达以及TMEM205和Polr2A的突变可能与卵巢癌化疗耐药有关。HLADPA1高表达患者对初始化疗的耐药性更强。可以发现，PDX模型在肿瘤的耐药机制方面有较大的研究价值。

5 PDX模型在卵巢癌药物治疗方面的应用

模型的药效学结果与临床患者对药物的反应具有较高的一致性。Topp等[14]采用NSG小鼠和12例卵巢癌患者的标本成功建立10例模型，成功率83%。随后其采用顺铂单药化疗(顺铂4 mg/kg第1、8、18天给药)。模型中4例铂敏感，3例难治，3例铂耐药，药物试验结果与患者情况基本一致。在卵巢癌靶向治疗方面，George等[20]建立了针对BRCA突变的卵巢癌PDX模型，发现具有高p-CHK1表达的BRCA2突变PDX模型对PARP、CHK1和ATR抑制剂的反应表现出与原发肿瘤相似的生长延迟。Ricci等[21]建立3例复发性铂耐药型EOC PDX模型，采用的治疗药物为紫杉醇(PTX)、贝伐珠单抗(BEV)及丝裂原活化的细胞外信号调节激酶抑制剂(MEK)。试验中将这三种药物两两组合或三药联用，结果显示三联效果优于二联，在二联用药中PTX/BEV＞BEV/MEK＞PTX/MEK。梅奥诊所的Harris等[22]利用全基因组配对二代测序(MPseq)方案，鉴定了几种对于ERBB2通路上编码基因突变的高级别浆液性卵巢癌，发现化疗及抗HER-2的靶向治疗的联合治疗方法能显著缩小PDX肿瘤。Heo等[13]同样发现EGFR抑制剂厄洛替尼对于透明细胞癌可能有效。Kreitzburg等[23]利用EOC PDX模型发现一种鞘氨醇类似物FTY720可以增加卡铂及他莫昔芬的抗肿瘤活性。

6 PDX模型在预测患者生存预后中的作用

Eoh等[24]研究发现，建模成功者往往较建模失败者无进展生存期更短，胚系突变更多。同时未经过新辅助化疗直接手术的患者中，建模失败的患者预后更好。Heo等[13]同样发现建模成功者总生存期更差。因此认为PDX模型可以作为预测预后的工具之一。

7 PDX模型存在的问题

虽然PDX模型用于卵巢癌的研究存在较多优势，但其同时存在一定的问题。1)建模费用高、时间长[25]。建模采用的免疫缺陷小鼠目前市场价格在0.6万/只左右，而药效学检测通常需经小鼠传代后在P2 ～ P3代模型完成，组织块皮下移植的方法建立的PDX模型生长缓慢。这就造成建模成功到药效学结束时间为4 ～ 6个月。建模成功后临床患者往往已经完成3 ～ 6个疗程化疗，模型的药效学结果无法及时应用于临床个体，因此大部分PDX模型用于临床前科研。Zhan等[26]及Zhang等[27]分别报道采用改良的PDX模型(mini PDX)药敏试验所筛选出的化疗方案能显著延长多种恶性肿瘤患者生存期，中位总生存期从13.9个月提高到18.6个月，无疾病进展期从12个月提高到17.6个月，且改良PDX周期短，仅7 d即可完成药敏试验，为PDX模型应用于临床提供了新的思路。但mini PDX模型技术刚出现，还未得到广泛认可。除此以外，目前还有一些快速的体外肿瘤细胞模型在科研中以及临床前应用，如类器官模型和三维肿瘤细胞模型[28-29]，但类器官的培养技术及体外模型与临床一致性还有待提高。2)PDX模型小鼠缺乏免疫系统。研究表明普通PDX模型的mRNA虽然能表现出高级别浆液性卵巢癌的所有分子亚型，但无法表现出其免疫反应亚组[30]，在药物免疫治疗及肿瘤发生免疫相关机制研究方面具有局限性。目前有新的技术将人的造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)移植于X线照射的重度免疫缺陷小鼠，然后再将患者的瘤组织移植于该小鼠建立人源化肿瘤模型，可以给肿瘤提供与人体更相似的生长环境[31]。同时，肿瘤基质包含了人的免疫细胞及细胞因子等成分，在肿瘤靶向治疗与肿瘤发生、发展、转移机制研究方面具有重要的应用价值，尤其在研究肿瘤免疫治疗方面，是更理想的肿瘤模型。然而，目前从肿瘤患者中分离出HSCs存在一定困难：一方面，在虚弱的人群中进行骨髓活检很困难；另一方面，生长因子刺激的HSCs骨髓动员至外周血可能会促进肿瘤进展。同时人源化肿瘤模型造价昂贵，推广存在困难。

8 结语

EOC PDX模型是评价上皮性卵巢癌药物疗效的良好临床前平台，其与患者的原代肿瘤在组织病理学、分子特征及药效反应等方面均保持良好的一致性，有助于解决卵巢癌耐药等临床问题，深化其应用有可能使临床治疗获得更高的成功率。但建立完美的PDX模型还面临着很长的道路，需要我们不断的探索。