FQ-PCR对一期、二期梅毒诊断价值的初步探讨＊

陶小华，王润贵，何美华

（江西省皮肤病专科医院，南昌 330000）

梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum，TP)引起的一种危害人类健康的性传播疾病，目前我国梅毒发病率仍在增加，梅毒在江西省也被列为重点防治的传染病，为有效防治梅毒传播，应尽可能早期发现更多的感染者[1，2]。梅毒血清学检查因敏感性和特异性均很高仍是梅毒诊断的优先方法，但该试验在窗口期可出现假阴性结果[3]。为寻找一种相对客观、阳性率高的检查方法来弥补梅毒血清学检查的不足，本研究初步探讨荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）对一期、二期梅毒的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 病例来源 从2016年12月-2018年10月之间，纳入临床怀疑为早期梅毒（如生殖器溃疡或皮肤、黏膜有可疑梅毒疹）的皮肤性病门诊患者，所有纳入患者均签订知情同意书。按照《中华人民共和国卫生行业标准-梅毒诊断标准》，本研究梅毒确诊病例满足以下3项标准：⑴有流行病学史；⑵临床表现；⑶非TP血清学试验和TP血清学试验均阳性。如TPPA、RPR结果不一致时，通过FTAABS试验来进一步验证。为排除前带现象，当TPPA阳性而RPR阴性时，均将此血清稀释后再做血清学试验。鉴于梅毒感染不足4周时TPPA可为阴性、不足6周时RPR可为阴性，本研究对所有病例在入组时以及随访2个月后分别予梅毒血清学检查以观察阳转情况。此外，对所有患者进行HIV、HSV-2检查等常规性病检查。梅毒确诊患者同时给予正规治疗。

1.2 样本采集 ⑴患者在被判断为疑似病例后，于次日清晨抽取5ml静脉血送至性病实验室进行RPR、TPPA、FTA-ABS试验。⑵FQ-PCR标本采集：渗出性溃疡采用无菌生理盐水将皮疹处冲洗干净后，用拭子将组织液挤出并采集；非渗出性皮肤黏膜损害取材用钝刀轻轻地刮数次 （避免出血），取组织渗液。标本采集后均置于无菌试管中，送至检查。

1.3 试剂 ⑴RPR、TPPA、FTA-ABS试验试剂盒购于上海荣盛生物公司。⑵FQ-PCR基因扩增选择已公布的TP-polA保守序列，达安基因股份有限公司设计一对引物，引物序列和探针序列及标记如下：上游引物 P1：5’-GGTCCTITGTCTITCGTA-3’；下游引物 P2：5’-CTACTTGCGATTGACCTGG-3’；荧 光 探 针 ：5’-(FAM)-ACACGCTCCTAACGTCCDAB-(MGB)-3’

扩增条件：预变性 93℃，2min；变性 93℃，45s；退火 55℃，60s；延伸 72℃，60s，共 40个循环。 标准品稀释、结果判定严格按试剂盒说明书进行。

1.4 统计学分析 Excel软件建立数据库，SPSS16.0软件统计分析，用描述性统计指标（%）统计各类样本的FQ-PCR阳性率，χ2检验统计不同临床样本FQ-PCR阳性率，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基本信息 共纳入134例具有皮疹被怀疑为早期梅毒患者，收集134份标本用于FQ-PCR检查，其中一期梅毒可疑（表现为溃疡）60例，二期梅毒可疑（表现为斑疹、丘疹或结节）74例。入组时RPR、TPPA均阳性58例，其中一期梅毒36例，二期梅毒22例。6例TPPA单阳性，经稀释血清均已排除前带现象。2个月后复检RPR、TPPA均阳性67例，较入组时增加9例，其中5例入组时RPR、TPPA均阴性，4例入组时RPR阴性、TPPA阳性，结合流行病学史、临床表现，共诊断一期梅毒41例、二期梅毒26例。入组时FQ-PCR阳性但RPR阴性11例，其中5例患者TPPA阴性、随访2个月RPR、TPPA均转为阳性；另外6例RPR阴性、TPPA阳性且经FTA-ABS试验验证全部阳性，4例HIV阳性、随访2个月RPR转为阳性，另外2例HIV阴性、随访2个月RPR仍阴性。这9例确诊梅毒中一期梅毒5例、二期梅毒4例。FQ-PCR阴性但RPR、TPPA均阳性12例，其中一期梅毒7例、二期梅毒5例。67例非梅毒中46.27%（31/67）被诊断出其他性病，其中19.35%（6/31）为生殖器疱疹。

2.2 FQ-PCR敏感性 一期梅毒FQ-PCR敏感性为95.12%（39/41），二期梅毒FQ-PCR敏感性为61.54%（16/26），两组敏感性有显著性差异 （P＜0.05）。7例梅毒中4例HIV阳性，FQ-PCR阳性4例，敏感性为100%，63例HIV阴性梅毒中FQPCR阳性51例，敏感性为80.95%（51/63），两组敏感性无显著性差异（P＞0.05）。

2.3 FQ-PCR特异性 FQ-PCR在67例非梅毒患者中2例阳性，特异性为97.01%（65/67）。

3 讨论

梅毒患者在感染早期，由于机体未能及时产生相应的抗体，或抗体量少，导致前期梅毒血清学检查结果往往呈阴性。一般感染梅毒后未治疗可在4周、6周之前特异性TP试验、非特异性TP试验出现假阴性，有报道一期梅毒梅毒血清学检查敏感性为86%左右[4]。本研究对入组时怀疑一期、二期梅毒患者分别在入组时、2个月后分别两次开展梅毒血清学检查发现梅毒血清学检查转阳9例，按照梅毒确诊的国家标准，梅毒血清学检查按入组时对一期梅毒的敏感性仅为78.05%。因此，一期梅毒需要寻找较梅毒血清学检查更为敏感的诊断方法。

梅毒传统诊断方法包括病原学检查和血清学检查。病原学检查有暗视野显微镜检查、镀银染色法、兔感染试验等，是临床上诊断梅毒的金标准。随着病程延长，机体免疫应答增强，导致梅毒螺旋体（Treponema pallidum，TP）数量减少或活力受限，造成暗视野镜检阳性率低。TP在镀银染色后呈深褐色，敏感性虽高于暗视野检查，但仍低于梅毒血清学检查[5]。兔感染试验（RIT）是取被检查病人的血清注射进兔子体内，可检查有否活的TP存在，但该方法费时且敏感性低，常规开展不切实际[6]。

随着TP-Nichols株和SS14株基因全序列的测定，为设计出更多的高特异性的PCR靶序列提供了依据。本研究采用的FQ-PCR融合了PCR的高灵敏性、核酸分子杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点，利用荧光信号的出现及其积累强度对PCR全进程进行实时测定，利用光信号值对未知模板进行定量分析，具有稳定性好、特异性强、灵敏度高等特点。本研究发现，与梅毒血清学检查比较，FQ-PCR诊断敏感性一期梅毒较高、二期梅毒敏感性较低，但两种检查诊断一期、二期梅毒的特异性无差异。理论上PCR方法可在各期梅毒样本中检查到TP-DNA，但其敏感性和特异性受多种因素影响：⑴靶基因。本研究选择检测TP已公布的特异性鉴别基因TP0105（polA）保守序列：GenBank TPU57757。PolA是一个编码多聚酶、广泛分布于生物体的保守基因，TP-polA与其他生物PolA无同源性，针对TP-polA建立的PCR法具有较好的特异性及敏感性，是一种相对客观的检查方法[7]。 ⑵梅毒分期。一期梅毒患者分泌物PCR检查敏感率明显高于梅毒血清学检查，随着病程延长，机体免疫反应逐渐变强，PCR的检查效能有所降低，PCR方法对二期梅毒敏感性和特异性均不如梅毒血清学检查[3]。⑶标本类型。当TP-PCR检查某些标本，如血、尿液、脑脊液，可能因其中存在PCR抑制因子而影响检查结果[7]。⑷PCR类型。例如巢式PCR利用两对引物进行两轮扩增，增加了检测的敏感性和特异性[8]。⑸合并其他感染。HIV感染可改变梅毒血清学检查结果[9]，本研究纳入梅毒合并HIV感染仅有4例，PCR诊断敏感性、特异性却未见显著影响。

综上，我们认为，当怀疑一期梅毒而梅毒血清学检查阴性时，FQ-PCR或可作为一个替代诊断方法使用。当然本研究也存在不足：⑴纳入样本量较少，且病例来自某专科三甲皮肤病医院性病科，存在选择性偏倚。⑵梅毒血清学检查两次间隔时间短，仅有2个月，而部分病例RPR、TPPA转阳时间可能会更长。⑶对可能会对FQ-PCR、梅毒血清学检查结果造成影响的因素未严格一一排除，如使用免疫调节剂等[10]。下一步我们将针对上述问题开展后续研究。