糖原合成酶激酶3β参与神经病理性疼痛的研究进展

李安然，连丽丽，姚 刚

(吉林大学第二医院神经内科，吉林 长春 130041)

神经病理性疼痛(neuropathic pain，NP)是指躯体感觉系统的损害或疾病导致的疼痛，分为周围性神经病理性疼痛和中枢性神经病理性疼痛2种类型，表现为自发性的感觉过敏、痛觉超敏或异位痛。其临床表现复杂多样，病程长，多数患者病程超过3个月，常常原发致痛病因已经消除或控制，疼痛仍长期存留，严重影响患者的工作、学习和生活[1]。外伤、神经压迫、感染、中毒、营养障碍、代谢紊乱、免疫、遗传、血管病变和肿瘤等多种因素均可引起神经损害，常见的病因包括带状疱疹感染、糖尿病、肿瘤压迫或浸润、化疗和放疗、慢性酒精中毒、梅毒或人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染、脑卒中、脊髓损伤、多发性硬化、创伤和术后神经损伤等[2]。NP发病涉及多种机制，包括外周敏化、中枢敏化、胶质细胞激活、离子通道改变和炎症反应等[3]。NP治疗主要采用钙离子通道调节剂(加巴喷丁和普瑞巴林等)、钠离子通道阻断剂(卡马西平和奥卡西平)、三环类抗抑郁药、血清素-去肾上腺素再摄取抑制剂、阿片类药物、神经调控技术、微创治疗和射频治疗等，但总体治疗效果仍不理想，慢性NP患者常伴随失眠、焦虑、抑郁甚至残疾，导致患者生活质量严重下降[3]。

糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的一种，参与细胞内多种重要生理功能，如细胞分化、增殖和凋亡等。GSK-3包括GSK-3α和GSK-3β 2种亚型，其中GSK-3β是细胞内多条重要信号通路的关键分子，肿瘤、糖尿病、神经退行性疾病和炎症等均与GSK-3β调节异常存在关联，GSK-3β抑制剂也被用于上述疾病的治疗。近年来，对炎症反应在NP病理过程中发挥作用的研究越来越多，促炎因子或介质在NP的发生和维持中起着重要的作用。有研究[4]显示：GSK-3β可以通过干预促炎因子与抗炎介质之间的平衡来参与NP的发生发展；基础实验[5]证实：应用GSK-3β抑制剂能够减轻模型动物的痛觉过敏，同时显著改善其疼痛症状。GSK-3β与NP的相关性研究为深入探讨NP发生机制、寻找新的治疗靶点提供了思路和方向。

1 GSK-3的生物学特性

GSK-3于1980年由兔的骨骼肌中首次提取纯化出来，是丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶，属于丝裂原活化蛋白(mitogen activated protein，MAP)激酶家族。GSK-3在哺乳动物中有GSK-3α和GSK-3β 2种亚型，分别由3和19号染色体编码，相对分子质量为51 000和47 000，二者整体氨基酸序列同源性为85%，中央激酶区域同源性高达98%[6]。尽管有高度的相似性和功能重叠，但2种亚型不可相互替代，敲除GSK-3α基因的小鼠尚可存活，GSK-3β功能的丧失或突变对于胚胎或新生小鼠是致命的[7]。GSK-3广泛分布于人体组织，在神经系统中，GSK-3α主要分布于海马、大脑皮层、纹状体和小脑，GSK-3β在大脑所有部位均有分布，主要表达于神经元及胶质细胞[8]。尽管GSK-3α和GSK-3β均参与神经功能调节，但大多数研究集中于GSK-3β亚型[9]。

GSK-3活性受到精细调节，涉及磷酸化、亚细胞定位以及与GSK-3结合蛋白之间的相互作用，其中GSK-3磷酸化是研究最多的调节方式。GSK-3β的负性调节因子是第9位丝氨酸(Serine)，该位点磷酸化后GSK-3β活性受到抑制；其正性调节因子是第216位酪氨酸(Tyrosine)，该位点磷酸化后GSK-3β活性得到增强[10]。GSK-3也能够使多种底物发生磷酸化，包括细胞结构蛋白、转录因子和细胞分裂起始因子等，在蛋白质合成、信号传递、细胞增殖与分化、神经功能和肿瘤形成等多种细胞生理活动中扮演重要角色[11]。

GSK-3作为一种下游调节开关，决定着多种信号通路在接受不同信号刺激后的反应和信息产出，其中经典通路包括：①Wnt-β-连环蛋白(Wnt-β-catenin)信号通路。GSK-3β在Wnt信号通路扮演重要角色，参与组成泛素蛋白酶，分解β-catenin使其保持在较低水平；当GSK-3β被抑制时，β-catenin在细胞质中堆积并进入细胞核，与转录因子结合启动下游靶基因的转录。GSK-3β可以通过该通路调节细胞的增殖、分化、运动和凋亡等过程，还在胚胎发育及成熟组织内稳态维持中发挥重要作用，该通路异常会导致细胞增殖失调控和肿瘤的发生[11]。②磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidlylinositol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)-GSK-3β信号通路。GSK-3β是最早发现的AKT的直接底物，二者结合后GSK-3β失活，导致转录因子、cAMP反应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)、信号转导和转录激活因子1激活，进而影响核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和tau蛋白等下游底物的生物活性[12-13]。③猬因子(Hedgehog)信号通路。在胚胎发育过程中，Hedgehog和Wnt信号通路协同作用，指导细胞增殖分化，GSK-3β参与Hedgehog信号通路主要是通过磷酸化GLI家族锌指蛋白(GLI family zincnger，GLI)，降解GLI 1和GLI 2，还可以水解GLI3形成抑制因子，使GLI蛋白转移到细胞核，激活Hedgehog信号靶基因的转录[14]。此外GSK-3β还可以通过调控微管动力学参与神经元的发育及轴突延长等。总之，GSK-3β是一种高度保守、多功能化的蛋白质，是调控多种细胞过程所必需的。

2 GSK-3β参与炎症反应

GSK-3β参与20多种转录因子活性的调控，其中包括与炎症有密切关联的NF-κB、CREB和转录激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3，STAT3)等。GSK-3β通过一系列生化反应最终调控炎症介质的表达，使炎症因子及趋化因子的生成增加，抗炎因子的生成减少。通路在调节宿主炎症反应过程发挥重要作用，炎症反应过程中，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作用于Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)，激活PI3K，促进肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)和白细胞介素12(interleukin-12，IL-12)等炎症因子和介质的产生，GSK-3β作为PI3K通路的下游激酶，可以选择性地调节LPS对TLR的激活，参与促炎因子与抗炎因子的平衡调节。2005年，MARTIN等[15]首次证实上述论点，此后该作用在外周单核/巨噬细胞、树突状细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞中得到证实[16]。研究者[15-17]还发现：在肝细胞中抑制GSK-3β，可以在不影响NF-κB的降解及核转位的情况下抑制NF-κB介导的转录，从而大大减少TNF-α、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和干扰素-γ(interferon-γ，INF-γ)等促炎因子的产生。在脓毒症中，GSK-3β也 可以通过活化STAT3，刺激胶质细胞产生IL-6，参与炎性损伤[18]。

白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)是一种主要的抗炎因子，可以抑制环氧化酶2(cyclooxygenase-2, COX2)、IL-1β和白细胞介素8(interleukin-8，IL-8)的表达，对于感染和炎症的稳态控制是必不可少的，而GSK-3β可以通过PI3K/AKT/GSK-3通路减少CREB核转位，进而抑制IL-10的表达[19]。在神经源性炎症中，星型胶质细胞和小胶质细胞中的GSK-3β被证实可以促进多种趋化因子的产生[20]。急性或慢性束缚应激研究[21]显示：啮齿动物额叶皮层Toll样受体4(Toll-like receptors-4，TLR4 )mRNA表达水平升高，进而使趋化因子CCL3、CCL4和CCL5的表达水平较正常增加20%以上，同时诱发TLR4信号下游的转录因子NF-κB的活化，进而诱导多种细胞因子和趋化因子的产生，而这一过程同样离不开GSK-3β的活化。

前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)同样参与炎症反应的调节，一方面其可以抑制促炎因子(TNF-α和IL-6)及趋化因子(CCL3和CCL4)等的产生，另一方面可以促进抗炎因子IL-10的合成，此外还可以影响T细胞向辅助型T淋巴细胞2(T helper 2 cell，Th2)的分化，而应用GSK-3抑制剂可以促进PGE2的产生[22-23]。在体外实验中，GSK-3β抑制剂可以使IL-6和一氧化氮(NO)的产生减少70%和80%，并上调CD116(小胶质细胞活化的一种标志物)和诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表达，GSK-3β可以选择性地促进LPS刺激后的iNOS表达，使NO生成增加[20，24]。GSK-3β还可以通过对IFN-γ的下游信号通路两面神激酶/信号转导及转录激活因子(janus kinase/signal transducers and activators of transcription, JAK/STAT)进行调控，参与IFN-γ对炎症调控的协同作用。

3 GSK-3β参与NP的病理过程

近年研究[9]表明：GSK-3β能够介导炎症通路并参与痛觉调制，抑制GSK-3β活性有利于减轻炎症和缓解疼痛。部分坐骨神经结扎(partial sciatic nerve ligation, pSNL)诱导的NP动物模型中，在第2～10 天观察到模型大鼠产生热痛觉过敏，第6～10天产生机械痛觉过敏，GSK-3β的活性测定显示其在第10天明显升高，应用GSK-3β抑制剂处理后第8～10天大鼠热痛觉过敏得到改善，第6～10天机械痛觉过敏也相应减轻，该实验首次证实GSK-3β可以激活脊髓背角星形胶质细胞参与热痛觉过敏和机械性异常疼痛[25]。短暂的瑞芬太尼接触可以提高疼痛敏感性，采用瑞芬太尼诱导的大鼠切口痛觉过敏模型，于给药前1 d和给药后2 h、6 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d进行机械和热痛实验，检测脊髓后角α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(α-amino-3 -hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor,AMPAR)亚基(glur1和glur2)转运、AMPAR磷酸化状态和GSK-3β活性，并采用全细胞膜片钳记录分析了GSK-3β抑制对脊髓背角AMPAR诱导电流的影响，结果表明：GSK-3β调节脊髓背角AMPAR的表达，抑制GSK-3β的活性可以明显减轻芬太尼引起的痛觉过敏[26]。在慢性坐骨神经压迫损伤(CCI)大鼠模型[27]中，磷酸化GSK-3β(pGSK-3β)(Tyr216)有长期增强趋势，pGSK-3β(Ser9)降低，而GSK-3β蛋白水平几乎不变，这是由于CCI模型大鼠脊髓中C-X-C族趋化因子5/C-X-C族趋化因子受体2(C-X-C motif chemokine 5/C-X-C chemokine receptor 2, CXCL5/CXCR2)上调并活化GSK-3β所致；鞘内CXCL5的释放可呈剂量依赖性地引起和维持高痛觉，而应用GSK-3β抑制剂可以预防该情况的发生。在瑞芬太尼诱导的NP小鼠模型中，GSK-3β mRNA和蛋白表达水平增加，pGSK-3β(Ser9)表达水平明显降低[28]。

紫杉醇为常用的癌症化疗一线药物，但长期使用往往引起感觉障碍及神经病理性疼痛。研究[28-29]显示：大鼠注射紫杉醇后的第10和20天，模型大鼠脊髓背角GSK-3β的活性增加，蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)则在相同区域和时间点的活性降低，同时伴随脊髓背角胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和IL-1β蛋白表达水平升高，谷氨酸转运体 1(glutamate transporter-1，GLT-1)蛋白表达水平下调；当大鼠预先接受锂(GSK-3β抑制剂)治疗时，以上生物标志物的变化基本被阻止，并且在第1次紫杉醇注射后的第11天逆转机械和热性异常疼痛，与此同时，GSK-3β活性增加、脊髓背角AKT和mTOR活性的降低也均被逆转，GLT-1、GFAP和IL-1β的蛋白表达随之改变，证明抑制脊髓GSK-3β活性是减轻紫杉醇诱导的NP的关键机制，同时也是改善脊髓GLT-1表达及抑制胶质细胞活化和IL-1β过量产生的有效方法。MARTINS等[30]应用醋酸和甲醛诱导小鼠伤害性感受，结果显示：GSK-3β抑制剂AR-A014418和NP031115均可以衰减模型小鼠的痛觉反应，提示GSK-3β参与痛觉调制，GSK-3β抑制剂具有镇痛作用。另有研究[31]显示：腹腔注射AR-A014418能够明显改善坐骨神经损伤模型小鼠的机械性痛觉过敏，其机制与调节血清素和儿茶酚胺途径、抑制促炎因子释放有关。GSK-3β能够调控CREB和NF-κB的核转位，从而调节促炎因子(TNF-α、IL-1β及IL-6)和抗炎因子(IL-10)的平衡，在疼痛的发生发展过程中发挥作用[15]。

4 GSK-3β参与NP的机制

NP的发病机制复杂，包括中枢敏化、周围敏化、胶质细胞激活和炎症反应等[32-33]。中枢敏化被认为是NP发生发展最基本也是最关键的机制，可以导致痛觉感受神经元突触传递增强和兴奋性异常升高，使神经元自发性放电增多、感受域扩大，外界刺激阈值降低、阈上刺激反应增强，放大疼痛信号的传递。周围敏化指的是长期慢性损伤导致周围神经放电、传导和神经递质改变以及炎症反应的发生，使得外周神经对疼痛刺激感觉过敏，并将信号上传至中枢，其中神经炎症是外周敏化形成的关键。

胶质细胞(星型胶质细胞和小胶质细胞)作为神经系统的主要免疫细胞，其生物活性的激活以及随后释放的促炎细胞因子在NP的发生和维持过程中同样具有关键作用[34]，在几乎所有的NP动物模型中，小胶质细胞和星形胶质细胞均被激活[35]。正常大鼠鞘内注射IL-1β和TNF-α可增强背角神经元的急性反应和终末活动，以及机械性痛觉异常和痛觉过敏[36]。抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的活化，可以减少体内细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，从而减轻神经损伤引起的痛觉过敏；同样，用IL-1β、IL-6和TNF-α拮抗剂治疗可降低炎症、神经损伤和吗啡耐受引起的超敏反应[37]。除了释放促炎细胞因子外，研究者[38]还发现：星形胶质细胞的激活与胶质细胞谷氨酸转运体(glutamate transporter，GLT)的功能障碍有关。脊髓背角胶质细胞GLT蛋白的下调有助于多种病理性疼痛的发生，包括神经损伤引起的神经性疼痛、化疗和吗啡耐受[39]。

研究[16,25,40-41]表明：GSK-3β可以通过促进外周敏化、中枢敏化和胶质细胞活化等多种机制参与NP的发生发展。GSK-3β能够激活巨噬细胞和单核细胞等炎症细胞释放促炎因子(TNF-α、IL-6和IL-1β等)、趋化因子及其他炎症相关介质[16]，上述介质直接或间接作用于外周伤害性感受神经元，通过上调传导神经元的兴奋性、改变离子通道，或者直接引起神经元痛觉过敏，导致外周敏化[40]。研究[25]显示：GSK-3β可以促进小胶质细胞增殖、迁移以及产生炎症因子，诱导炎症引起的神经毒性，应用GSK-3β抑制剂可以减少小胶质细胞的迁移和促炎反应。应用GSK-3β抑制剂还可以减少星型胶质细胞活化标志物GFAP的表达，提示GSK-3β也参与了星型胶质细胞的活化[41]。

脊髓谷氨酸受体的过度激活是脊髓背角神经元异常活动主要原因，其主要受3个因素的影响：突触释放谷氨酸的量、GLT清除谷氨酸的速率和突触后谷氨酸受体的活性。而GLT-1是中枢神经系统中主要的谷氨酸转运体，GSK-3活性增强使得GLT-1下调，谷氨酸堆积，诱导机械痛和热痛觉；也可以增加谷氨酸的再摄取进而增加谷氨酸的释放量，由此产生中枢敏化[25]。N-甲基-D-天冬氨酸(n-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)受体在突触可塑性和慢性疼痛形成中起重要作用[42]。GSK-3β可以促使NMDA受体中的NR1和NR2B亚基从细胞内到细胞表面的转移增加，加强NMDA受体介导的转运功能，NMDA转导活性增强，细胞内钙离子数量增加，微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic current，mEPSC)的幅度及频率增加，神经元兴奋性增加，诱发中枢敏化[13]。在中枢神经系统中，痛觉传导系统的兴奋和抑制一直保持着平衡，除了传导神经元的兴奋性增强可以导致中枢敏化外，抑制作用的减弱同样也会引起中枢敏化。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是中枢神经系统中的主要抑制性神经递质，由抑制性神经元释放，通过作用位于痛觉传导纤维的受体参与疼痛抑制。机体通过谷氨酸-谷氨酰胺循环合成GABA，而GSK-3β可以抑制谷氨酸的转运，从而使得神经胶质细胞谷氨酸摄取不足，导致GABA能神经突触强度降低而使其抑制作用下降，非伤害性刺激即可引起机体产生疼痛，诱发中枢敏化[43]。

5 展 望

神经炎症是许多神经系统疾病的共同病理生理特征，如阿尔茨海默病、艾滋病伴发的痴呆、多发性硬化和精神分裂症等，GSK-3活性改变或调节异常在其发生发展过程中起关键作用，抑制GSK-3β活性的药物可以改善上述疾病的症状[44-45]。GSK-3β与疼痛的关系是近年来研究的一个新的热点，越来越多的研究证明GSK-3β与NP有着密切的联系。GSK-3β通过介导炎症通路、胶质细胞活化和神经递质改变等参与NP发生的神经敏化。GSK-3β抑制剂对不同NP动物模型的热痛觉过敏和机械性异常疼痛等均有明显的改善作用，提示GSK-3β及其相关通路是NP发生和维持的关键步骤，未来需要进一步研究调节GSK-3β活性的上游通路和GSK-3β影响脊髓感觉调控的下游信号通路，为探讨NP的发病机制和镇痛药物开发提供新的思路。