TGF-β 通路在椎间盘退变分子生物学进程中作用机制的研究进展

王乙

（长春中医药大学继续教育学院，吉林 长春 130021）

下腰部疼痛是目前骨科门诊中最常见且频发的健康问题之一。全球超过80%的成年人曾有过下腰部疼痛的病史［1］，且长期的下腰部疼痛最终会导致残疾并带来巨大的经济负担。研究［2］显示：椎间盘退变是导致下腰部疼痛主要病因。椎间盘退变时椎间盘组织内的基质蛋白和水含量急剧下降，导致纤维环组织强度减弱，髓核在压力作用下从薄弱的纤维环处突出，通过机械压迫、化学刺激和炎症反应等方式刺激神经根，引发坐骨神经痛等症状［3］。目前，针对椎间盘退变病因的研究已深入至分子生物学水平，椎间盘退变与椎间盘细胞流失、细胞外基质合成与降解失衡和局部炎症反应有密切关联。而多种生长因子在维持椎间盘代谢稳态中起到关键作用，其中转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）被证实在椎间盘退变分子生物学进程中起到关键调控作用［4］。但目前尚无系统性综述回顾TGF-β 通路在椎间盘退变分子生物学进程中的作用机制。结合国内外相关文献，本文作者首次总结了椎间盘退变中TGF-β 表达差异和下游通路情况，并回顾了TGF-β 抑制类药物对于椎间盘退变的研究进展，旨在分析TGF-β 通路在椎间盘退变中的作用机制及通过调控TGF-β 通路对椎间盘退变的治疗情况。

1 TGF-β 通路

哺乳动物体内，TGF-β 家族包括TGF-β1、TGF-β2 和TGF-β33 个成员，虽然其分子结构高度相似，但因表达顺序和激活状态的差异，导致其发挥着不同的生物学功能［5］。所有的TGF-β 成员初始均表达为非活性的前体状态，由一条潜在相关多肽和一条成熟多肽链连接而成。TGF-β 通过潜在相关多肽和TGF-β 结合蛋白连接的二硫键稳定维持在细胞外基质中。而在椎间盘中，持续的负荷刺激通过整合素-10 将力学信号转化传递为化学信号，促进TGF-β 的活化和释放。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）和活化氧等因子也参与了TGF-β 的激活［6］。

在TGF-β 激活过程中，成熟多肽链转变为相对分子质量为25 000 的二聚体作为与细胞表面TGF-β 受体复合物连接的配体，参与TGF-β 的激活。TGF-β 受体复合物是由一对跨膜的TGF-βI型受体（TβRIs）和一对TGF-βⅡ型受体（TβRⅡs）组成的具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的四聚体［7］。在四聚体形成初期，TGF-β 配体与TβRⅡs 结合，并在特定的丝氨酸和苏氨酸残基上使膜旁区TβRIs的甘氨酸-丝氨酸结构域发生反式磷酸化。TβRIs也被称为激活素受体样激酶（activin receptor-like kinases，ALKs），在经典信号通路中，激活的ALK5 在丝氨酸羧基端将SMAD2 和SMAD3 磷酸化，同时激活的R-SMADs 与SMAD4 形成三聚体复合物，而此三聚体复合物转移至细胞核内，通过刺激或抑制靶基因表达发挥功能［8］。而TβRIs 包含ALK1 和ALK5 2 种不同的结构类型，激活的ALK1 调节SMAD1/5/8 磷酸化，而磷酸化的SMAD1/5/8 与SMAD2/3 在组织中常发挥相反的生理功能。此外，TGF-β 还可以激活非SMAD 依赖的非经典信号通路，如丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）通路等，以发挥特异生理学功能［9］。

2 TGF-β 在椎间盘发育中的作用

椎间盘由生骨结和脊索中的细胞发育而来。在胚胎第10 周时，脊索外部体节细胞开始分化，形成梭形的纤维母细胞，随后发育成为纤维环组织。而在胚胎第18 周时，中胚层脊索组织逐渐发生黏液化，最终形成髓核组织［10］。在胚胎期，TGF-β参与椎间盘发育中的脊索基质调控，并诱导体结分化形成纤维环细胞［11］。研究［12］表明：靶向敲除TβRⅡs 的Col2a1-Cre 转基因小鼠会导致椎间盘发育不全，甚至完全缺失。另外，SMAD3 基因敲除鼠中亦可观察到脊柱后凸畸形，并表现出椎间盘高度、胶原和蛋白多糖含量下降等椎间盘退变表现。PECK 等［13］发现：小鼠胚胎发育时从受精卵至胚胎期12.5 d 期间TGF-β 表达的变化，证实TGF-β在胚胎发育阶段对椎间盘发育起到的核心调节作用。TGF-β 在出生后小鼠椎间盘发育过程中也起到关键性作用。通过Col2a1-CreERT2构建的T βRⅡCol2ER小鼠特异性地抑制了纤维环细胞与脊柱周围软骨细胞中TGF-β 通路的作用。在此转基因鼠出生早期可观察到其终板发育不良，终板高度和厚度明显小于正常小鼠，且MMP-13 等基质降解蛋白相关基因表达水平明显升高，提示TGF-β 在椎间盘的形成和发育过程中均发挥重要作用［14］。

3 TGF-β 在椎间盘中的表达

研究［15］表明：TGF-β 和TGF-β 受体的表达水平随着年龄及椎间盘退变的进展而发生改变，但不同的研究结果［16-23］间存在较大差异，甚至得出截然相反的结论。在衰老小鼠模型中，免疫组织化学染色结果表明：TGF-β 和TGF-β 受体随着年龄增长而表达水平降低；与2 月龄鼠比较，18 月龄鼠椎间盘中的pSMAD2/3 的表达水平亦明显降低［16］。研究［17］表明：3 岁龄家兔髓核和纤维环组织内TGF-β1 mRNA 表达水平则明显低于6 月龄家兔。2～48 周龄大鼠的髓核和纤维环内TGF-β 表达水平随年龄增加呈相反的变化趋势［18］。

在人椎间盘组织内，TGF-β 表达水平情况报道不一致。NERLICH 等［19］提取了30 具无椎间盘退变的新鲜尸体中的椎间盘组织和12 具有椎间盘退变的尸体中的椎间盘组织，结果显示：TGF-β1 表达与椎间盘退变间存在密切联系；后续研究［20］证实：TGF-β1 的表达在退变椎间盘中明显上调，并与椎间盘退变病理分型呈正相关关系［20］。另外，SCHROEDE 等［21］发现：TGF-β1在退变椎间盘的髓核中表达水平降低，而在纤维环中表达水平明显升高。ABBOTT 等［22］观察显示：与轻度椎间盘退变比较，在严重退变椎间盘的髓核细胞内TβRI 下调更加明显。与正常组织比较，突出髓核中TGF-β1 mRNA 表达水平差异无统计学意义［23］。综上，椎间盘中TGF-β 的表达水平随着物种、年龄、组织和细胞类型及检测方法不同存在着较大差异。椎间盘中表达的TGF-βs 以无生物活性的状态为主，而实际发挥信号转导作用的TGF-β通路与组织中TGF-β 表达量呈不完全相关。

4 TGF-β 在椎间盘退变中的相关作用机制

椎间盘退变的病理学特征包括细胞外基质含量下降、细胞流失和炎症反应等。而TGF-β 通路则可通过调控以上3 个方面对椎间盘退变进行修复。

4.1 抑制细胞外基质降解并促进细胞外基质合成椎间盘内细胞外基质代谢稳态的改变是椎间盘退变重要的标志之一，其表现为细胞外基质的合成和降解代谢失衡［24］。退变时，椎间盘中的组织细胞和炎症细胞持续释放一系列炎症因子，如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）等，造成MMPs 和去整合素等分解代谢酶类表达水平升高［25］。TGF-β 可以通过MAPK 和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路在一定程度上逆转炎症因子诱导的基质降解酶类表达上调，起到保护基质的作用［26］。微小RNA（microRNA）通过靶向TGF-β 通路参与椎间盘退变过程中的基质降解，而通过TGF-β 调控microRNA 水平亦成为椎间盘退变治疗的新手段［27］。

在抑制基质降解的同时，TGF-β 通路还参与促进椎间盘中基质的合成过程。胶原、蛋白聚糖和糖胺聚糖是椎间盘中3 种重要的基质组分［28］。蛋白聚糖能与透明质酸结合形成复杂三位结构网络，与蛋白聚糖结合的糖胺聚糖带有负电荷，吸引阳离子在髓核中形成高渗透压［29］。研究［30］表明：TGF-β SMAD2/3、RHOA/ROCK 和MAPK 等通路刺激糖胺聚糖的合成。在髓核细胞中，TGF-β则通过促进CCN-2 表达、抑制CCN-3 表达以诱导蛋白聚糖的分泌［31-32］。此外，在椎间盘退变的器官和动物模型实验中，TGF-β 可促进糖胺聚糖、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达［33-34］。值得注意的是，用于研究的模型动物均为低龄动物，而TGF-β 对于椎间盘基质合成的作用也随着年龄变化而变化。因此，还需后续研究TGF-β 在高龄椎间盘退变动物模型中的椎间盘基质合成作用。

4.2 促进细胞增殖并抑制细胞凋亡在退变的椎间盘中，椎间盘细胞处于多种复杂微环境中，如低氧、力学负荷、低pH 值、缺乏养供和高渗透压等，降低了细胞活性，并可诱导细胞发生凋亡［35］。研究［36-37］表明：TGF-β1 能上调纤维环细胞增殖率，并具有刺激多种利于细胞增殖的生长因子，IGF-1和FGF-2 的协同作用。在小鼠髓核细胞中，外源性给予TGF-β1 能够通过调控c-Myc 和MAPK 通路影响细胞周期以增高细胞增殖率［38］。研究［39］显示：SMAD 能够通过抑制Wnt/β -连环蛋白（β-catenin）通路来维持高钾状态下大鼠髓核细胞的增殖。

TGF-β 除能够促进细胞增殖外，还具有缓解细胞凋亡和延迟椎间盘退变的作用［40］。细胞凋亡和自噬是引起椎间盘退变的关键致病因素之一［41］。TGF-β 则可以通过抑制自噬而减少乏养状态下纤维环细胞的凋亡，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和MAPK 则被证实是抑制纤维环细胞凋亡的核心通路［42］。研究［43-44］显示：受体相互作用蛋白激酶1（RIPK-1）通路介导的细胞凋亡是造成髓核细胞死亡的主要原因，但后续未进行相关研究以证实对RIPK-1 信号通路抑制后退变椎间盘中髓核细胞的存活和凋亡情况。细胞衰老是椎间盘退变的主要诱因之一，而TGF-β 则是调节细胞衰老凋亡的重要信号通路，然而，其对椎间盘细胞衰老调控作用的机制尚不清楚，仍有待深入探究。

4.3 抑制炎症反应炎症反应与椎间盘退变的进展紧密相关。退变的椎间盘基质会产生多种化学因子，如单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemotactic protein1，MCP-1）和趋化因子配体4（CCL-4）等，诱导巨噬细胞聚集于退变椎间盘组织处，广泛的巨噬细胞浸润则会引起炎症因子的分泌，TNF-α和IL-1β 为其中主要的炎症因子，并会进一步上调基质分解代谢酶，加速椎间盘退变的进展速度［45］。TGF-β 的治疗则会在抑制TNF-α 和IL-1β 分泌的同时，降低由于炎症反应上调的MMPs 的表达，起到抑制炎症和防止基质降解的功能［46］；另一方面，TGF-β 可以通过抑制炎症因子上游环节的表达而起到抑制炎症的作用。胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphocytic production，TSLP）与IL-7 同源，通过刺激MCP-1 引起巨噬细胞在退变椎间盘组织的局部募集［47］。内源性TGF-β 通过抑制NF-κB 活化而抑制TSLP 的稳定表达。TGF-β可以通过激活MAPK 通路下调CCL-4 的表达。因此，活化的TGF-β 通路可以通过抑制炎症的起始和发展，进而缓解椎间盘退变时的局部炎症状态［48］。

5 过度激活TGF-β 通路导致椎间盘退变加剧

TGF-β 被认为是一种多效能细胞因子，其表达水平的高低可诱发不同的疾病状态［49］。TGF-β的激活在胚胎发育和早期肿瘤抑制过程中起到重要作用，但过量表达的TGF-β 则会引起组织纤维化并促进晚期肿瘤的发展［50］。而TGF-β 剂量相关性的生理学作用在关节疾病的发展中也起到重要调控作用。在健康关节软骨中，TGF-β 处于基本正常表达状态，其通过激活SMAD2/3 通路维持软骨细胞表型稳态。但在骨性关节炎软骨中，由于TGF-β 及其受体表达异常，TGF-β 的异常激活则会通过SMAD1/5/8 通路促进骨性关节炎［6］。TGF-β 过度表达会加速椎间盘退变的发展［51］。在小鼠椎间盘退变模型中，异常机械负荷会导致TGF-β 信号过度激活而加速退变速度，而TβRI 抑制剂则通过抑制受体调节型SMAD（receplor regulate SMAD，R-SMAD）信号有效抑制椎间盘退变的进展［52］。在家兔纤维环缺损模型中，通过注射TGF-β 抑制剂氟尿嘧啶可以有效延缓纤维环的退变速度［53］。在牛髓核细胞退变过程中，TGF-β 同时激活SMAD2/3 和SMAD1/5/8 正反2 条通路，而激活的SMAD1/5/8 对SMAD2/3 具有负调控作用，可导致椎间盘进一步的退变［54］。而在人软骨细胞中则验证了ALK1 依赖的SMAD1/5/8 信号转导可以抑制TGF-β/ALK5 依赖的SMAD3 的转录活性，可解释为不同剂量TGF-β 造成了R-SMAD 的差异性激活所致［55］。

尽管上述研究结果提示TGF-β 通路的异常激活可能是椎间盘退变的原因之一，但其证据仍不充足。首先，研究对象主要针对鼠和兔等实验动物，而针对人类椎间盘组织中TGF-β 对椎间盘退变的影响仍缺少相关研究证据；其次，TGF-β 通路的表达水平和R-SMAD 的激活随年龄和椎间盘退变的进展而发生变化，但目前TGF-β 对椎间盘退变影响的相关研究模型主要为机械暴力所致，而非年龄老化所致。因此，在后续研究中有必要探究不同年龄阶段和不同椎间盘退变阶段个体中TGF-β 表达情况对疾病进展的作用；最后，TGF-β 信号转导在椎间盘退变中的不良反应作用机制仍不清楚，有待于进一步研究。

6 TGF-β 通路用于椎间盘退变治疗的前景

目前，椎间盘退变的TGF-β 通路疗法大致可分为以下几种策略：①激活的TGF-β 通路直接增加细胞外基质沉积、抑制细胞流失和炎症反应，直接修复退变的椎间盘；②利用TGF-β 通路与组织工程学手段相结合，用以间接修复退变的椎间盘。一方面，TGF-β 可与其他细胞因子发挥协同作用，促进间充质干细胞分化为髓核样细胞，增加椎间盘成熟细胞数量，缓解椎间盘退变的速度［56］；为进一步验证分化的髓核样细胞生理特性和功能，需针对间充质干细胞分化而成的髓核样细胞进行表型检测［57］。另一方面，TGF-β 介导了间充质干细胞和髓核细胞间的信息传递，其利于椎间盘细胞的表型稳定，并促进退变椎间盘的再修复［58］。此外，随着可注射型水凝胶和自组装肽支架等多种组织工程生物材料等迅速发展，将TGF-β 与上述材料进行复合可以实现细胞因子的缓释，避免了TGF-β 爆发性释放造成的局部毒性效应，并可长期发挥对间充质干细胞的诱导分化作用，有效驱动间充质干细胞介导的椎间盘再生［59］。然而，TGF-β 信号的过度激活已被证明会加速椎间盘的退化，因此，TGF-β 信号的适度激活是椎间盘治疗的关键。抑制TGF-β 的异常表达也是一种治疗椎间盘退变有效的手段。局部应用TGF-β 抑制剂治疗椎间盘退变具有较大研究潜力，但仍需要对给药剂量、给药时间和给药方法等具体问题进行探索筛选，开发出一套适合TGF-β 的抑制给药系统以缓解TGF-β 过度表达对椎间盘的破坏。

7 总结

TGF-β 信号在椎间盘的发育、生长和组织内稳态调控中均起到重要作用。TGF-β 信号的激活对椎间盘退变具有良好的治疗前景，但过度激活TGF-β 信号则会导致椎间盘的破坏，加速退变的进程。因此，后续研究还需进一步探究椎间盘退变的不同疾病进程阶段TGF-β 信号的表达情况和相应分子机制，只有深入理解TGF-β 信号对椎间盘退变的作用机制，才能安全有效地实现TGF-β 治疗椎间盘退变的临床转化。