波形蛋白在肝细胞癌中的研究进展

董保龙，韩彩文，史 明，郑文学，杨晓军*

(1.甘肃中医药大学 临床学院，甘肃 兰州 730000； 2.甘肃省人民医院 普外二科，甘肃 兰州 730000)

2018年全球恶性肿瘤统计数据示，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)发病率和病死率分别位居恶性肿瘤中的第6位和第3位[1]。在中国，其新发病率及病死率分别位居所有恶性肿瘤第4位及第3位[2]。HCC起病隐匿，病情进展快，预后差，高侵袭性和转移率是难以有效治疗的主要原因。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是细胞发生形态学和表型改变的过程、肿瘤发生侵袭转移的重要环节，与预后不良密切相关[3]。同时，EMT异常激活是HCC化疗耐药、免疫逃逸、侵袭转移和术后复发的重要机制[4]。EMT过程中上皮特征性细胞分子细胞黏附因子(E-cadherin，E-ca)表达下调，间质特异性VIM上调，且波形蛋白(vimentin，VIM)是EMT的标志物和HCC侵袭转移的关键分子[5]。HCC血清中VIM水平明显升高，联合AFP诊断HCC时特异性和敏感性显著提高[6]。

近年来，随着对EMT研究热潮的发现，其与肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)、DNA甲基化和外泌体存在密切的关联，促进HCC的发生发展。而VIM作为EMT的标志性分子参与或调控上述重要机制，且在HCC的早期诊断和治疗发挥着重要作用。故深入研究VIM有望成为HCC潜在的生物标志物和治疗靶点。

1 VIM生物结构及其表达在HCC中的临床意义

1.1 VIM生物结构

VIM是高度保守一种Ⅲ型中间丝纤维蛋白，属于中间丝蛋白家族中的一员，其变化使得细胞骨架发生重排、细胞外基质重塑，从而获得间质细胞特征，细胞侵袭性增强[5]。VIM有N端结构域、中心杆状结构域和C端结构域3部分组成，磷酸化和糖基化位点结构域主要位于N端和C端，主要调控信号传导。中心杆状结构域具有α螺旋区域可抑制蛋白酶体降解，对VIM起保护作用[7]。

1.2 HCC中VIM的表达及临床意义

VIM在表达于间质细胞，其表达使得细胞形态发生改变，获得侵袭转移能力。HCC组织中VIM表达显著高于其癌旁组织，距癌组织越近VIM表达越高[8],且在肝炎病毒感染的HCC组织中VIM显著增加[9]。HCC患者血清VIM水平显著高于正常人水平，晚期HCC患者VIM水平显著高于早期HCC患者[10]。此外，VIM阳性表达者生存率明显低于阴性表达者，与预后密切相关[10]。同时，血清中VIM水平升高在检测小肝癌时，灵敏度为40.91%，特异性为87.50%，优于血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)，且VIM与AFP (≥100 ng/mL)联合检测小肝癌时，灵敏度竟上升到58.77%，特异性为98.15%[6]。综上所述，VIM表达在HCC发生发展中发挥着重要作用。

2 VIM参与调控EMT

表型的变化是复杂基因变化的结果，VIM在基因表达[11]、蛋白间相互作用[7]、磷酸化[12]3个层面上调控EMT，进而介导肿瘤发生发展，促进细胞侵袭转移。

2.1 VIM直接或间接诱导基因表达调控EMT

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)参与细胞多种生命活动，在基因修饰过程中作为转录调节因子、转录后加工因子、染色质重塑因子和剪接调节因子，促进或抑制恶性肿瘤进展，在肿瘤的诊断和治疗中发挥作用。lncRNA通过多种途径调控EMT的发生[13]，介导肿瘤耐药、侵袭和复发转移[14]。 LncRNA GAS5在HCC细胞系及HCC组织中呈低表达，促进侵袭转移，与HCC预后密切相关[11]。在HCC细胞系中使GAS5过表达[15]，结果显示VIM表达降低，E-ca表达增加，显著抑制细胞间质表型和细胞侵袭转移能力。Spearman相关性分析结果显示GAS5负性调控VIM表达。且后续在过表达GAS5细胞系中沉默VIM后，细胞侵袭转移能力下降，且GAS5表达上调。因此推测，VIM可能是直接或者调控GAS5的表达，促进或者抑制EMT从而介导HCC侵袭转移。

2.2 VIM与其他蛋白相互作用抑制其降解调控EMT

骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是一种多功能蛋白，参与机体多种病理生理过程。随着对OPN深入研究，OPN是HCC发生的启动因子，其表达水平和侵袭转移能力密切相关[16]。为了探索OPN侵袭转移的分子机制，筛选出4株稳定低表达OPN的人源型HCC细胞，利用过表达和敲除模型，发现过表达OPN细胞系具有典型间质细胞表型，侵袭转移能力显著增强，VIM和EMT转录因子Twist1表达增高、E-ca表达下降，发生典型的EMT效应[7]。低表达的细胞系却没有明显变化，从而确定OPN过表达能够引起EMT效应。用免疫共沉淀联合质谱技术筛选出相关蛋白-VIM，发现VIM α螺旋区域有OPN的结合位点，结合后抑制了泛素-蛋白酶体降解途径，抑制 VIM降解从而VIM稳定性增加。此外，沉默VIM后细胞表型发生了逆转，且调控EMT的关键基因Axl表达也随之下调，OPN引起的EMT征象被逆转。

综上，VIM与其他蛋白相互作用，抑制其降解，提高其稳定性，发挥EMT效应促进HCC的进展。

2.3 VIM磷酸化调控EMT

PI3K/AKT信号通路已在多种肿瘤发现，参与肿瘤侵袭转移、增殖凋亡、EMT等多种细胞活动[17]。AKT1、AKT2、AKT3是AKT的3个亚型，AKT1在肿瘤侵袭转移已被广泛研究，AKT1尾端与VIM头端相互作用，VIM可被AKT1磷酸化，磷酸化可以保护其免受caspase诱导的蛋白水解作用，增强细胞侵袭转移能力，作为EMT效应分子，促进EMT[12]。

3 VIM甲基化、VIM参与肿瘤干细胞和外泌体介导的HCC侵袭和转移

3.1 HCC中VIM甲基化

DNA甲基化是最为常见的表观遗传学调节方式之一，是非DNA序列改变所致的基因表达水平的变化，调控许多肿瘤相关基因的表达[18]。目前认为DNA甲基化可以作为肿瘤早期诊断的生物标志物和预后评估指标，对肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗检测都有重要的意义[19-20]。采用定量甲基化特异性PCR检测43例HCC组织和相应的癌旁组织VIM基因甲基化状态[20]，结果显示43例中24例出现VIM基因的异常甲基化，且与TNM分期、血清中AFP水平和肿瘤大小密切相关。近来，随着测序技术的不断提高，利用半导体测序技术，检测42个法国HCC患者和42个健康人，以及来自泰国的42个HCC患者、26个慢性肝病患者和42个健康人进测序评估VIM基因甲基化，结果表明,VIM基因甲基化水平在HCC患者中显著增高，且VIM基因甲基化水平与HCC分期呈正相关[19]。

综上，VIM基因甲基在HCC形成之前早已发生, 并且甲基化的不同水平出现HCC发展的各个相应阶段。VIM基因甲基化有望成为HCC生物标志物。

3.2 HCC中VIM形成间质表型肿瘤干细胞

肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)是一类具有自我更新、高致瘤性、多向分化潜能、高度耐药等特性的细胞，是恶性肿瘤耐药以及术后复发的根本原因。CSCs标志物有CD133、醛脱氢酶(ALDH)、CD44、CD24、EGFR、HER2和EMT标志性蛋白(VIM；E-ca)以及EMT转录因子(Snail、Slug、twist、Zeb1、Zeb2等)[21]。随着CSCs标志物分离技术的的提高，HCC中分离出了一类CD133-VIM+和CD133-VIM-的CSCs，由于VIM的表达，从而获得EMT表型，且证实了CD133-VIM+是一类具有EMT表型的CSCs[22]。在两种细胞中分别进行了细胞周期分析、分化潜能和体内外致瘤实验，结果发现，具有EMT表型的CSCs(CD133-VIM+)G1-S-G2期细胞数量明显高于CD133-VIM-的CSCs；CD133-VIM+有着更高的分化潜能和致瘤能力。

因此，在HCC中VIM形成间质表型肿瘤干细胞，获得EMT表型，使HCC或者侵袭转移能力增加。

3.3 外泌体直接或者间接分泌VIM

外泌体是大小为40～100 nm由多种细胞分泌的微小膜泡，携有蛋白质、脂质、miRNA和循环DNA等多种活性物质，是细胞间信息交流的功能载体，参与多种病理生理功能，不同细胞分泌的外泌体具有不同的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。EMT由多种致癌因子或其他因素引起，外泌体亦是EMT的参与者。外泌体中的多种蛋白、miRNA参与了肿瘤细胞的EMT过程，影响肿瘤的侵袭与转移能力。此外，肿瘤细胞分泌的外泌体作为信息载体调控EMT，促进肿瘤细胞侵袭转移[23]。结肠癌中纤维细胞分泌的外泌体携带的miR-92a-3p激活Wnt/β-catenin信号通路从而激活EMT，VIM作为EMT的效应分子高表达，促进结肠侵袭转移[24]。HCC分泌的外泌体中还有Rab27a，激活MAPK/ERK信号通路诱导EMT发生，促进HCC进展[25]。HCC细胞分泌肿瘤外泌体，向周围组织或血液等扩散，诱导VIM表达使肿瘤细胞获得EMT表型，为肿瘤细胞的转移、侵袭准备物质基础[8]。

4 问题与展望

目前，HCC的早期诊断受限于发现时间太晚以及诊断过程的烦琐、费用昂贵等因素。因此，在人体体液内寻找和检测肿瘤细胞分泌的靶基因可能会是一种新颖的、无创的、高度可靠的诊断方式。而基因甲基化、循环肿瘤干细胞以及外泌体已成为“液体活检”研究热点。VIM作为EMT的标志性分子，参与或调控上述研究热点使其获得EMT表型，促进HCC的发生发展。故随着基因检测及分离技术突破，VIM有望成为液体活检的热点，为HCC患者提供潜在的诊断标志物和治疗靶点。