复方维生素E口腔药膜含量测定方法研究*

曲 婷，陈 岩，2△，乔宏艳，刘 亮，李小红

（1．哈尔滨医科大学附属第一医院药学部，黑龙江 哈尔滨 150001； 2．厦门大学附属翔安医院药学部，福建 厦门 361101）

膜剂为药物与适宜的成膜材料经加工制成的膜状制剂，供口服或黏膜用［1］。美国药典（USP）中也收载了膜剂（Films），简单描述其为置于口腔内的薄片，可能含有一层或多层，层中可能含有原料药，通常是由聚合物构成的薄膜材料，通过快速释放到口腔给药。复方维生素E口腔药膜为我院自制膜剂，临床主要用于治疗口腔溃疡、皮肤角化症及湿疹等慢性皮肤病［2-5］。口腔黏附用膜剂薄而软，能将药物直接释放至黏膜表面，快速吸收。与生物黏附凝胶剂相比，膜剂最大的优点是成形性好，给药后可直接黏附于给药部位，不会分散，可保持原状持续释药，故剂量准确。

维生素E分为合成型（dl-α-生育酚醋酸酯）或天然型（d-α-生育酚醋酸酯）［5］，为微黄色至黄色澄清的黏稠液体，不溶于水，溶于无水乙醇、丙酮等有机溶剂，在空气中会缓慢氧化，紫外线照射可使其分解、色渐变深。维生素E是人体非常重要的阻断自由基链式反应的抗氧化剂，通过影响炎性因子、调节细胞信号转导，在抑制炎性反应、抗自由基、抗衰老、抗癌变过程中发挥重要作用［6-8］，具有稳定和保护细胞膜的作用，在人体正常新陈代谢中不可或缺，已广泛用于治疗多种皮肤病［9-10］。维生素E在本制剂中含量最高，故作为其含量控制指标性成分，采用超声波提取、高效液相色谱法测定，但此方法回收率低，不适用于药膜中维生素E的定量。本研究中对比了超声波、热回流、索氏提取、醇沉等提取方法对药膜中维生素E的影响，以高效液相色谱（HPLC）法测定其含量，作为前处理评价指标，为膜剂中该药物的质量评价提供准确可行的检测方法，为膜剂中药物含量测定前处理方法的选择提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1．1 仪器

Waters 600型高效液相色谱系统（美国Waters公司），包括2996 PDA检测器、717自动进样器；SB3200型超声波仪（必能信超声＜上海＞有限公司）；AE200型电子天平（梅特勒-托利多仪器＜上海＞有限公司）。

1．2 试药

维生素E对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100062-201110，供HPLC测定，含量为97．7%）；复方维生素E口腔药膜（医院自制，批号分别为200171121，20171128，20171130，20171205，20171207，20171212，规格为每片含维生素E 6 mg）；甲醇与异丙醇均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱：Sinochrom ODS-BP柱（200 mm×4．6 mm，5μm）；检测波长：284 nm；流动相：甲醇-异丙醇（88∶12，V／V）；流速：1．0 mL／min；柱温：40℃；进样量：10μL。

2．2 溶液制备

对照品溶液：称取维生素E对照品约100．0 mg，精密称定，置100 mL棕色容量瓶中，先加入适量无水乙醇充分溶解，再用甲醇定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为1．0 mg／mL的维生素E对照品贮备液，置4℃冰箱中保存，备用。

供试品溶液：取本品20片，剪碎至大米粒大小，得药膜碎片，备用。1）超声波提取。称取相当于3片的上述药膜碎片，精密称定，置100 mL棕色容量瓶中，加适量无水乙醇，置超声波（120 W，40 kHz）中，超声处理60 min，放冷至室温，加甲醇至刻度，混匀，0．45μm滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液Ⅰ。2）热回流提取。称取相当于3片的上述药膜碎片，精密称定，置圆底烧瓶中，加适量无水乙醇，置加热套中，热回流60 min，放冷至室温，转移至100 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，混匀，0．45μm滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液Ⅱ。3）热溶醇沉提取。称取相当于3片的上述药膜碎片，精密称定，置离心管中，加少量热水溶解后，边滴加适量无水乙醇边搅拌，离心，上清液转移至100 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，混匀，0．45μm滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液Ⅲ。

阴性对照品溶液：按处方量称取处方中除维生素E的其他药用原料及辅料，按制备工艺制成不含维生素E的阴性制剂，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2．3 方法学考察

系统适用性试验：取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液，按拟订色谱条件进样测定，色谱图见图1。结果显示，基线平稳，维生素E与杂质峰分度良好，空白辅料及杂质对目标峰无干扰，且柱效高，峰形理想。

线性关系考察：取2．2项下维生素E对照品贮备液，精密吸取2．5，5．0，10．0，20．0，40．0 mL，分别置50 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，最终配制成质量浓度分别为50，100，200，400，800μg／mL的溶液。按拟订色谱条件分别进样测定，记录色谱图，以维生素E质量浓度（X，μg／mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y＝3 228．7X-17．083，r＝0．999 9（n＝5）。结果表明，维生素E质量浓度在50～800μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。

检测限与定量限确定：精密吸取2．2项下维生素E对照品贮备液适量，加甲醇逐级稀释后，按拟订色谱条件进样分析。结果维生素E的最低检测限（LOD）为0．25μg／mL［信噪比（S／N）＝3］，最低定量限（LOQ）为1．0μg／mL［信噪比（S／N）＝10］。

精密度试验：取2．2项下质量浓度为8μg／mL的对照品溶液适量，按拟订色谱条件连续测定3 d，每天重复测定6次。结果维生素E色谱峰面积的日内精密度RSD为0．64%（n＝6），日间精密度RSD为1．13%（n＝3），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2．2项下质量浓度为8μg／mL的对照品溶液适量，按拟订色谱条件分别于室温条件下放置0，1，2，4，8 h时进样测定。结果维生素E峰面积的RSD为0．71%（n＝5），表明供试品溶液室温放置8 h内稳定性良好。

图1 高效液相色谱图

重复性试验：取同一批（批号为20171128）复方维生素E口腔药膜6份，按2．2项下“热溶醇沉提取”方法分别制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样分析，计算含量。结果维生素E的标示量分别为99．6%，102．7%，104．1%，99．4%，102．4%，100．8%，RSD为1．84%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量（6．09 mg／片）的复方维生素E口腔药膜（批号为20171128）6份，均分为高、低浓度加样组（n＝3），分别精密加入18 mg和6 mg维生素E对照品，按2．2项下“热溶醇沉提取”方法制备加样回收试验供试品溶液，按拟订色谱条件进样分析，计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n＝3）

提取方法确定：取同一批（批号为20171128）复方维生素E口腔药膜，按2．2项下3种提取方对药膜进行前处理，每种方法平行制备3份供试品溶液，按拟订色谱条件进样分析。结果见表2。

表2 3种前处理方法提取维生素E后HPLC检测结果（n＝3）

2．4 样品含量测定

分别取复方维生素E口腔药膜样品6批，按2．2项下“热溶醇沉提取”方法分别制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样分析。结果见表3。

表3 样品含量测定结果（X±s，n＝3）

3 讨论

检测方法选择：除《中国药典》规定的气相色谱法外，维生素E的含量测定方法还有气质联用法、HPLC法、液质联用法、紫外分光光度法等［11-17］，但膜剂中维生素E的含量测定方法尚未见报道。气相色谱法所用的内标物正三十二烷在市场难以购买，导致日常分析较困难，且样品前处理较烦琐。本研究中采用高效液相色谱仪、外标法测定，操作简便，结果准确，优于气相色谱仪采用的内标法进行定量。

检测波长选择：取维生素E对照品溶液，无水乙醇溶解，甲醇稀释，在190～450 nm波长范围内扫描，记录光谱图，维生素E在204 nm及284 nm波长处均有吸收峰。考虑到前者为边缘吸收，受溶剂等因素的影响较大，故选择284 nm作为检测波长。

流动相选择：曾选用以甲醇-水（95∶5，V／V）、甲醇-乙腈（95∶5，V／V）为流动相，结果均因其色谱峰分离效果不好而未被采用。最终采用甲醇-异丙醇（88∶12，V／V）作为流动相，可使主峰的保留时间缩短。采用HPLC法以反相色谱柱进行分析［12，18］，多以水和甲醇为流动相，易造成脂溶性大分子化合物在柱内沉淀，污染色谱柱，也可能使色谱峰峰形不理想。本研究中采用的HPLC法是以甲醇和异丙醇为流动相，使脂溶性维生素E不残留在柱内，能减少维生素E的保留时间，并提高了柱的稳定性，保持柱分离效能，延长其使用寿命。

提取方法选择：2015年版《中国药典》中收载了4种膜剂，含量测定的前处理方法均经过剪碎、超声波提取或有机溶剂热水浴2个步骤。其中剪碎过程费时费力，超声波提取耗时长、噪音大，热水浴耗时长，且会导致有机溶剂挥发，存在环境危害和人体损害。本研究中根据脂溶性主药维生素E与水溶性辅料聚乙烯醇的理化性质差异，设计了将药膜放入少量纯化水中，水浴加热呈溶解状态，将维生素E从药膜中完全释放出来，然后边滴加适量无水乙醇边搅拌，聚乙烯醇遇有机溶剂变性产生絮状沉淀，待沉淀不再增加，停止搅拌，离心，取上清液。整个过程耗时短，操作简便。本研究中考察了超声波法、热回流法、热溶醇沉法提取药膜中的维生素E。分别将药膜剪碎成花生米大小、黄豆大小、大米粒大小，甲醇为提取溶剂，采用超声波法和热回流法，分别于提取10，20，30，60，90 min时取样，HPLC法测定维生素E含量。试验结果表明，2种方法提取率与药膜的粉碎度和提取时间、提取温度成正比，但提取60 min后，提取率不再增加。其中，超声波法提取不完全，测定结果为标示量的75．2%；热回流法提取率高于超声波法，为标示量的93．0%，也未达到完全提取；热溶醇沉法提取，HPLC法测定维生素E含量，结果为标示量的100．1%。表明热溶醇沉法提取完全，操作简便、快捷，低浓度加样组和高浓度加样组平均回收率均较高，方法准确可靠。