叶酸通过KDM6A影响神经管发育

高 军，李建婷，谢 秋，张永峰，乔丽娜，刘长云，王建华

(1.潍坊医学院 临床医学院，山东 潍坊 261053； 2.山西医科大学 生物化学与分子生物学教研室，山西 太原 030001；3.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 中心实验室, 北京 100730； 4.潍坊医学院附属医院 儿科,山东 潍坊 261053; 5.首都儿科研究所 生化免疫研究室, 北京 100020)

神经管畸形(neural tube defects，NTDs)主要包括无脑畸形、露脑畸形、脊柱裂、脑或脑膜膨出等神经系统发育异常[1]，占新生儿出生疾病前列[2]，病死率高，预后差，给患者、家庭和社会带来严重负担。目前推断病因主要由遗传和环境等因素共同决定[3]。孕期妇女叶酸缺乏会导致NTDs患儿出生概率增加[4]。赖氨酸去甲基化酶(lysine-specific demethylase 6A，KDM6A)可以催化H3K27me3去甲基化，能够促进基因的表达，在胚胎发育过程中有重要作用[5-6]。低叶酸环境使得DNA双链断裂(double strand breaks, DSBs)增加[7]。KU70/80是非同源性末端接合(non-homologous end joining, NHEJ)途径中重要的修复蛋白，对于DSBs的修复非常关键[8]。低叶酸环境中KDM6A是否介导NHEJ途径参与哺乳动物DSB修复从而影响NTD的产生目前并无文献报道。

本研究采用小鼠胚胎干细胞(SV129)、NTD小鼠模型以及NTD人标本研究KDM6A在低叶酸环境中的异常表达如何影响DNA断裂修复过程，继而导致NTD的产生。从表观遗传学的角度对神经管畸形的发生机制展开新的探索。对于提升孕期妇女保健工作、提高新生儿质量、减轻社会负担产生积极影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、动物及人标本：小鼠胚胎干细胞SV129(中国科学院干细胞与生殖生物学国家重点实验室)；SPF级小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，合格证号：11400700350429，60只，8周龄，体质量16～25 g；人群标本(首都儿科研究所NTDs生物样本库)。本研究已获得首都儿科研究所伦理委员会的批准(文号：DWLL2016004)。

1.1.2 试剂：胎牛血清、DMEM、GlutaMAX-Ⅰ和NEAA(Gibco公司)；β-巯基乙醇、明胶(Sigma Aldrich公司)；leukemia inhibitory factor (LIF)(Millipore公司)；结晶紫染液、DAPI(北京索莱宝科技有限公司)；PBS[康宁(上海)管理有限公司]；甲醇(Cell Signaling Technology公司)；蛋白裂解液、多聚甲醛、丽春红染色液(上海碧云天生物技术有限公司)；兔抗KDM6A抗体稀释(Abcam公司)；小鼠抗KU70/80抗体(Santa Cruz公司)；Supersignal west femto trial kit(Thermo Fisher Scientific公司)；山羊抗小鼠抗体、山羊抗兔抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 SV129细胞的培养：向含有15%胎牛血清的DMEM培养基中加入1%的GlutaMAX-Ⅰ，1% NEAA以及1% β-巯基乙醇，细胞培养之前在培养瓶中加入0.2% 明胶，37 ℃浸洗15 min，然后加入培养基，种植细胞，加入0.1‰ 白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)，放置于37 ℃含5% CO2培养箱中培养。待细胞贴壁面积达75%时，实验组加入0.2 μL 甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)，对照组添加正常培养基。

1.2.2 结晶紫染色细胞：用PBS冲洗单层细胞，弃掉冲洗液。每个小皿中加入 PBS/甲醇1 mL，静置2 min，弃掉PBS/甲醇1 mL。加入新甲醇5 mL，静置10 min；弃掉甲醇，将培养皿倒干净，使其干燥；每个小皿中加200 μL，静置10 min；用PBS冲洗小皿，将多余染料冲尽，然后在镜下观察形态。

1.2.3 Access 2 Immunoassay法测量细胞及组织叶酸：将细胞收集混匀，并使用竞争性受体结合免疫测定法测定叶酸浓度，并使用Access 2 Immunoassay系统完成读数。根据制造商的说明进行实验。细胞收集在1 mL Tris-HCl缓冲液中，然后以15 s运行，45 s静置超声处理9个循环，以4 ℃、10 000 r/ min、离心3 min，测上清液，读出叶酸浓度。

1.2.4 Western blot检测KDM6A及KU80蛋白表达：在培养后的SV129细胞中加入蛋白裂解液，然后冰上20 min裂解，5 000 r/min离心10 min，收集上清液，用BCA法测定提取蛋白浓度，随后进行SDS-PAGE电泳(12%分离胶、12.5%浓缩胶)，蛋白上样量统一为30 μL，起始电压设置为80 V，30 min后样品进入分离胶，电压调整为120 V，然后进行60 min电泳，反应结束后将蛋白凝胶转移至PVDF膜上，在冰中保存，电流设置为300 mA，进行2 h转膜反应，加入PBST溶液进行清洗后，丽春红染色，选择合适条带，加入5%脱脂牛奶常温进行封闭1 h，用PBST将PVDF膜进行清洗3次，每次10 min。加入一抗稀释液，4 ℃ 过夜，加入PBST溶液清洗3次，每次10 min，加入二抗稀释液，室温下孵育2 h，PBST清洗3次，每次10 min，然后加入Supersignal west femto trial kit后用凝胶成像仪成像分析。

1.2.5 免疫荧光检测γ-H2AX及KDM6A：将细胞在培养皿中培养至75%面积以上。弃去培养基，用PBS 洗2次。加入200 μL冰上预冷的4%多聚甲醛，室温固定细胞10 min。将4%多聚甲醛弃掉，缓缓注入500 μL PBS进行清洗，每次5 min，重复3次。加入200 μL 0.5% Triton X-100(PBS配制)进行细胞透化处理10 min。弃去液体，用PBS室温浸洗细胞5 min。每个小皿加入500 μL免疫荧光封闭液，室温封闭60 min。将封闭液弃掉，缓慢滴注一抗稀释液250 μL，4 ℃过夜。弃去一抗稀释液，轻柔注入500 μL PBS，清洗3次，每次清洗5 min。每皿缓慢滴注二抗稀释液250 μL，室温孵育1 h。注意避光。去除二抗，轻柔注入500 μL PBS，清洗3次，每次5 min。200 μL DAPI染核，避光保存，在荧光显微镜下观察。

1.2.6 小鼠NTD模型的构建：参考前期动物建模处理[9]。将成熟的雄性和雌性小鼠交配过夜；次日清晨检测到阴栓者为受孕。将阴栓的存在时间指定为胚胎0.5 d(E 0.5 d)的时间点。在胚胎10.5 d，通过颈椎脱位处死怀孕的小鼠并取出胚鼠，然后在显微镜下观察胎鼠的表型，以此区分正常胚胎及NTD胚胎。分离并获得胚胎及相应的脑组织。

1.2.7 RT-PCR检测KU70/80：用RNA提取试剂提取细胞或组织的总RNA，用反转录试剂盒将其反转录为cDNA。KU80、KU70以及内参GAPDH引物由上海生工公司合成，其中KU80 上游引物：5′-AAGTCCGCAAAAATGTGTGGC-3′，下游引物：5′-A TTTCATCGGTGTCGCAACC-3′；KU70上游引物：5′-CCATGGTCGATGACTTTGA-3′，下游引物：5′-GAAA ATTGAACGCCAAACAGGG-3′；GAPDH 上游引物：5′-GTCATCCATGACAACTTTGG-3′，下游引物： 5′-G ATCTCGACAAAGTGGTCGT-3′。反应体系：10× cDNA底物模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，H2O 8 μL，2×SYBR GREEN MIX 10 μL。按照反应程序25 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s，50个循环。利用EXCELL 2016软件进行Cq值分析，以GAPDH作为内参基因进行相关比较。

1.2.8 人标本的采集：生物样本库中随机选取30对人NTD以及正常标本分组后进行相关实验。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞在低叶酸环境中DNA断裂增加并且KDM6A蛋白表达减少

加入MTX之后，细胞团在对照组及MTX实验组中未发生明显变化(图1A)。MTX实验组叶酸含量明显低于对照组(P<0.05)(图 1B)。低叶酸环境会增加DNA的断裂。通过DNA断裂特异性标记蛋白-γ-H2AX，在MTX组中，γ-H2AX的表达量明显增加(图 1C)。通过对γ-H2AX的免疫荧光实验发现MTX组的γ-H2AX表达高于对照组(图 1D)。MTX组KDM6A明显低于对照组(图 1E)，同时免疫荧光实验发现MTX组中KDM6A表达量低于对照组(图 1F)。

2.2 小鼠NTD表型中DNA断裂修复基因表达降低

在正常小鼠和NTD小鼠模型中，发现NTD胚胎脑后组织出现膨出(图 2A)。分别取其脑部位进行RNA提取。KU70和KU80是NHEJ修复途径重要基因，结果KU70和KU80在NTD标本中表达都下降(P<0.05)(图 2B)。

2.3 人低叶酸NTD标本KDM6A与KU80表达明显减少

人NTD标本中叶酸含量低于正常标本(P<0.05)(图3A)。发现NTD标本中KDM6A和KU80表达低于正常标本(图3B)。对这两者的表达量进行相关性分析，结果显示，NTD组KU80的表达与KDM6A的表达较正常对照标本呈显著正相关(P<0.001)(图3C)。

A.cell crystal violet staining(×20); B.determination of cell folate concentration;*P<0.05 compared with control group; C.γ-H2AX protein Western blot experiment, α-Tubulin as an internal reference protein; D.cellular γ-H2AX immunofluorescence experiment, blue is dapi staining, green is γ-H2AX protein staining, and MERGE is a combination of the two(×60); E.KDM6A protein Western blot experiment, H3 as internal reference protein; F.KDM6A immunofluorescence experiment, blue is dapi staining, red is KDM6A protein staining, MERGE is the combination of the two(×60)

3 讨论

神经管畸形(NTD)是一种严重的先天性缺陷病，是胚胎发育21 d到28 d神经管闭合障碍，造成的严重的中枢神经系统先天性异常的疾病[10]，中国是神经管发病的大国。神经管畸形是遗传、环境以及两者交互作用等因素共同决定的。其中叶酸缺乏与NTDs的表达明显相关，具体分子机制不清。

KDM6A位于X染色体短臂11.3(Chr.Xp11.3)，是H3K27me3的特异性去甲基化酶，而H3K27me3对于基因的表达具有调控作用，KDM6A可能通过对H3K27me3的去甲基化从而促进基因的表达。本研究从细胞、人、动物模型的3个层次研究了KDM6A在低叶酸环境中对断裂DNA修复的影响。

A.E 10.5 d is a normal embryo on the left and an NTD embryo on the right (brain bulging) (×20); B.RT-PCR analysis of mouse embryo KU70 and KU80;*P<0.05 compared with normal group

A.determination of folate content in human tissue;*P<0.05 compared with normal group; B.human tissue KDM6A protein and KU80 protein Western blot experiment, β-actin as internal reference protein; C.correlation of KDM6A and KU80 expression in the normal and NTD groups

图3 NTD人标本中叶酸含量的测定以及KDM6A的表达情况
Fig 3 Determination of folate content in NTD human specimens and expression of KDM6A

叶酸低神经管畸形发生的分子机制未有详细的报道。在山西的发病案列中可以看到，该地区的NTD的确与叶酸的低摄入相关，而根据前述，低叶酸环境能够促进DSB的产生。目前已知，γ-H2AX是敏感的、专一的DNA损伤标记。它是核心组蛋白H2A亚单位H2AX蛋白C末端139位的丝氨酸迅速发生磷酸化引起的。通过发生磷酸化，γ-H2AX对于修复蛋白KU70和KU80具有募集作用[11]，从而促进DNA断裂修复的进行。KU70和KU80是非同源性末端结合的关键蛋白，二者在DNA断裂时迅速被γ-H2AX招募[12]，在DNA双链断端形成“套扎”结构，防止DNA双链的继续断裂以及发挥对其他相关修复基因的招募作用，从而完成对断裂DNA的修复[13]。

本实验发现经过MTX的诱导，小鼠胚胎干细胞细胞内处于低叶酸环境，并且KDM6A的表达量降低，符合报道[14]。人NTD标本中，叶酸含量降低，KDM6A的表达减少，与细胞情况一致。在小鼠NTD诱导模型中出现了DNA修复基因表达减少的情况。而KDM6A对于基因的激活有促进作用，而在NTD模型中KDM6A的表达降低可能是导致DNA修复基因KU70/80表达降低的原因。

本研究发现NTD可能是与低叶酸环境中DNA断裂增加、KDM6A表达下降，导致DNA断裂修复基因的表达降低，引起DNA断裂修复异常有关。从表观遗传学的角度对NTD的发生进行了相关探索，对促进实施优生优育政策以及减少家庭、社会负担起重要作用。