黑灵芝多糖对丙烯酰胺致大鼠肝脏氧化 损伤的保护作用

江国勇，雷艾彤，杨 莹，余 强，谢建华，陈 奕

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

丙烯酰胺（acrylamide，AA）是一种应用广泛的工业化学品，同时还普遍存在于炸、烘、烤等高温食品中，与人类生活环境密切相关[1-3]。然而，AA具有多种生理毒性，已被国际癌症研究机构列为“可能人类致癌物”（2A类）[4]。由于AA是一种水溶性小分子物质，渗透性强，人体可通过消化道、呼吸道、皮肤黏膜等多种途径接触并吸收AA，在消化过程中可以快速分布于全身的组织中造成毒性[5]。肝脏是AA毒性的靶器官之一，研究表明AA能诱导肝细胞产生过量活性氧（reactive oxygen species，ROS），消耗解毒过程中的重要物质谷胱甘肽（glutathione，GSH）并引起脂质过氧化（丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量增高），引起肝细胞氧化损伤[6-8]。

以往对AA的研究主要集中在其形成抑制方面，尤其是在热加工过程中如何采取各种措施以降低食品中AA的含量，然而，中西方饮食习惯导致人体无法避免地长期暴露在低水平AA环境下。因此如何削弱AA体内毒性，寻找可拮抗AA毒性的天然产物，构建人类AA毒性防护的第二道屏障具有重要意义。近年来大量研究表明，多种植物来源天然产物对生物来源的ROS具有显著的清除和抑制作用。Gedik[9]和Shrivastava[10]等研究发现，藏红花素和橙皮素处理AA染毒的大鼠后，抗氧化酶活力得到显著提升，炎症缓解，一定程度上缓解了AA毒性。Alturfan等[11]研究发现白藜芦醇对AA致大鼠氧化应激和DNA氧化损伤起到保护作用。大型植物真菌黑灵芝（Ganoderma atrum）在我国作为药食同源食品已有2 000多年历史，然而关于黑灵芝来源的天然产物对于AA体内毒性的抑制作用尚无报道。本课题组的前期研究[12-13]报道了一种从黑灵芝子实体中分离出的黑灵芝多糖（Ganoderma atrumpolysaccharides，PSG），对其结构表征发现，PSG的主要水溶性成分PSG-1是一种由酸性1,3-糖苷键连接支链、1,6-糖苷键连接β-Glcp主链的杂多糖-蛋白质复合物，其分子质量为1 013 kDa，由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和半乳糖醛酸以物质的量比为4.91∶1∶1.28∶0.71组成。众多体内外研究表明PSG具有抗氧化防御能力，能够改善过氧化氢诱导的氧化应激，在清除自由基功能方面尤其突出[14-16]。

本课题组最近一项研究[17]表明，PSG能通过改善IEC-6细胞氧化应激和线粒体凋亡途径有效抑制AA毒性，然而到目前为止，关于PSG对AA诱导的肝脏损伤是否具有保护作用鲜见报道。因此，本研究旨在探讨PSG对AA诱导大鼠肝脏氧化损伤的保护作用，以期为PSG的充分应用与深度开发提供一定的理论依据，同时为AA膳食防治提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑灵芝购于江西赣州灵芝基地。清洁级雄性SD大鼠（体 质量160～180 g，生产许可证号：SCXK（湘）2016-0002，使用许可证号：SYXK（赣）2005-0001）购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

AA（纯度＞99.9%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙转氨酶（alanine transaminase，ALT）、甘油三酯（triglyceroles，TG）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒 南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、BCA蛋白浓度试剂盒 上海碧云天生物科技有限公司；白细胞介素（interleukin，IL）-1β、 I L-1 0 酶联免疫吸附测定试剂盒 武汉博士德 公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

3K15高速台式离心机 德国Sigma公司；3001全波长扫描式多功能读数仪（多功能酶标仪） 美国Thermo公司；A10超纯水仪 美国Millipore公司；2HWY-2102生化培养箱 上海森信实验仪器公司；KZ-II组织破 碎仪 武汉塞维尔生物科技有限公司；AL104型电子 天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PSG的提取制备

黑灵芝子实体经粉碎机反复粉粹处理至粉状细微颗粒，用体积分数95%乙醇溶液浸泡24 h后，采用改良的热水浸提醇沉法提取PSG。将浸提液旋蒸浓缩至原体积1/5，采用Sevag法脱蛋白处理，脱蛋白后依次用自来水透析2 d、蒸馏水透析1 d、超纯水透析1 d，再用体积分数95%乙醇溶液沉淀，沉淀物分别用无水乙醇、丙酮、无水乙醚各洗涤2 次，浓缩，冷冻干燥，得到精制PSG。

1.3.2 AA诱导大鼠肝损伤模型的建立

选取健康雄性SD大鼠60 只，体质量160～180 g，于12 h明暗交替条件下适应1 周。随机分为6 组，每组10 只：1）正常组：等体积的生理盐水；2）模型组：20 mg/kgmbAA溶液；3）阳性对照组：200 mg/kgmbN-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）；4）PSG低、中、高剂量组：PSG 50、100、200 mg/kgmb。各给药组在给予相应药物0.5 h后，口腔灌胃AA水溶液，连续30 d。最后1 次给药后，禁食不禁水18 h处死，进行相关指标测定。

1.3.3 大鼠一般情况观察

实验期间观察大鼠的精神状态、行为、毛发光泽度、有无死亡情况等，拍照并记录。

1.3.4 肝脏病理检测

取大鼠肝脏部分右叶（后续测定取肝脏左叶相应部位），生理盐水清洗，滤纸吸干，于体积分数10%中性福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，切片，苏木素-伊红（hematoxylineosin，HE）染色，光镜下观察组织切片并拍照。

1.3.5 肝功能指标测定

采用眼球取血法，室温放置2 h，待血清分层后于4 000 r/min、4 ℃下冷冻离心10 min，吸取上层血清部分，－80 ℃条件下保存备用。按照检测试剂盒步骤测定血清ALT、AST、ALP活力和TG浓度。

1.3.6 肝脏氧化指标测定

称取100 mg肝脏组织加入900 μL生理盐水制备肝脏组织匀浆液，于8 000 r/min、4 ℃下离心15 min，吸取上清液，根据检测试剂盒步骤测定SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量。

1.3.7 免疫指标测定

采用1.3.5节所制血清样品，按照检测试剂盒步骤测定血清IL-Iβ、IL-10质量浓度。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 16.0软件进行数据分析，所有实验均重复3 次， 结果以平均值±标准差表示；采用Graph Pad Prism 6 软件作图；采用单因素方差分析和Tukey’s多因素t检验进行方差分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 大鼠一般情况观察及死亡率

在AA造模期间，各组大鼠均未出现中毒死亡。AA染毒第20天，模型组大鼠开始出现抱团嗜睡、后肢瘫痪并容易被激怒的现象，且毛发凸起失去光泽（图1B），表明灌胃AA第20天AA的蓄积毒性作用开始体现。

图 1 AA造模期间大鼠一般情况Fig. 1 General conditions of normal and AA-treated rats

2.2 PSG对AA致大鼠肝脏组织病理变化的影响

图 2 PSG对AA致大鼠肝脏损伤的组织病理变化影响 （HE染色）（200×）Fig. 2 Effect of Ganoderma atrum polysaccharides on AA-induced hist opathological changes in rats (HE staining) (200 ×)

由图2可知：正常组肝脏组织结构正常，肝细胞以中央静脉为中心，向四周呈发散性排列，细胞排列致密，肝细胞索排列规律，无充血和炎性细胞浸润，核仁清晰（图2A）；模型组肝索断裂，细胞质大量丢失，空泡严重，且细胞核固缩较严重，出现炎症细胞浸润 （图2B）；相对于模型组，阳性对照组和PSG低剂量组肝索恢复，核仁清晰，排列整齐，空泡化现象基本缓解，仅有少量细胞质丢失（图2C、D）；PSG中、高剂量组基本接近于正常组（图2E、F）。上述结果表明，AA染毒使大鼠肝细胞核固缩，细胞质丢失，导致肝细胞坏死，从而损伤肝脏组织；而PSG和阳性药物干预处理后，肝细胞组织形态趋于正常，提示PSG对AA致大鼠肝脏损伤具有较好的保护作用。

2.3 PSG对AA致大鼠肝脏功能损伤的影响

图 3 PSG对AA致大鼠肝功能损伤的影响Fig. 3 Effect of Ganoderma atrum polysaccharides on liver function injury induced by AA in rats

由图3可知，与正常组相比，模型组大鼠血清中AST、ALT、ALP活力均极显著升高（P＜0.01），TG浓度显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，NAC处理后，阳性对照组大鼠血清中AST活力和TG浓度得到一定程度降低，但不显著，ALT和ALP活力显著降低（P＜0.05）。与模型组相比，低、中、高剂量PSG处理后，大鼠AST、ALT、ALP活力和TG浓度均极显著降低（P＜0.01），降低程度远大于阳性对照组。结果表明，AA染毒后各项肝功能指标显示大鼠肝脏受到损伤，同时PSG对AA致大鼠肝损伤具有显著的保护作用，且其效果远远优于NAC。

2.4 PSG对AA致大鼠肝脏氧化损伤的影响

氧化应激是肝脏损伤的重要机制之一。体内自由基代谢的平衡主要通过抗氧化系统维持，主要包括SOD、GSH-Px、CAT等，MDA是脂质过氧化物降解的主要产物，MDA的含量也能间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度[18]。

由表1可知，模型组大鼠中MDA含量极显著高于正常组（P＜0.01），NAC和低、中、高剂量PSG均能够极显著降低大鼠体内MDA含量（P＜0.01）。灌胃AA后，肝组织抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活力均极显著降低（P＜0.01），而NAC和不同剂量PSG处理均能不同程度地提升抗氧化酶活力，且PSG尤其是高剂量时，其提升抗氧化酶活力的能力远大于NAC。结果提示，PSG能够维持大鼠体内抗氧化系统，提高抗氧化酶活力，同时降低脂质过氧化，从而缓解AA导致的大鼠肝脏损伤。

2.5 PSG对AA致大鼠肝脏损伤中血清炎症因子水平的影响

图 4 PSG对AA致大鼠肝脏损伤中血清炎症因子IL-1β（A）、IL-10（B）质量浓度的影响Fig. 4 Effect of Ganoderma atrum polysaccharides on serum IL-1β (A) and IL-10 (B) levels in rats with AA-induced liver injury

炎症细胞因子参与炎症反应，在众多炎症细胞因子中，起主要作用为IL-1β、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子等。由图4可知，与正常组相比，模型组大鼠中血清IL-1β质量浓度极显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，阳性对照组和PSG处理组大鼠体内IL-1β质量浓度均显著降低（P＜0.01，P＜0.05）。与模型组相比，中、高剂量PSG能够极显著提高血清IL-10质量浓度（P＜0.01）。以上结果表明，灌胃不同剂量的PSG均可以有效缓解AA导致的炎症反应，抑制AA诱导的大鼠肝组织中促炎细胞因子IL-1β的表达，并提高抗炎因子IL-10水平，从而达到对肝脏的保护作用。

3 讨 论

AA对人类健康造成潜在的重大风险，包括致突变性、遗传毒性、致癌性[19]。肝脏是主要的解毒代谢器官，因此也成为AA的主要靶器官之一。本实验结果表明，AA处理后，大鼠血清AST、ALT和ALP活力 （P＜0.01）及TG浓度（P＜0.05）显著或极显著增加。ALT和AST是动物体内2 种重要的转氨酶，正常情况下在血清中很少，但当肝脏发生损伤时，肝细胞结构受到一定破坏，AST、ALT就会漏出至血液，因此血清中AST、ALT活力变化可以作为肝脏受到损害时的一种应答反应[20-21]。 肝脏受损时胆汁循环受阻，ALP活力升高，同时导致机体对游离脂肪酸的利用减少，血液中游离脂肪酸水平升高，导致血清中TG浓度升高，因此血清中TG浓度也间接反映了肝脏受损程度[22]。氧化应激是AA损伤的主要机制之一[2]。Jiang Guoyong等[17]的研究结果提示，在IEC-6细胞模型中，AA能刺激IEC-6细胞产生过量ROS。Ghorbel等[1]发现不同剂量的AA可诱导破坏肝细胞中促氧化剂和抗氧化剂平衡而引起氧化损伤。机体接触AA后会通过酶与非酶系统产生ROS。当ROS增多至超过机体清除自由基能力时，机体内抗氧化系统就会失衡，从而发生氧化损伤。Luo等[23]研究发现AA及其代谢物（缩水甘油酰胺）能与GSH结合形成共轭异构体，AA给药后体内GSH水平降低。在氧化应激状态下，GSH消耗可能会导致脂质过氧化。MDA是脂质过氧化的主要产物。MDA水平升高提示机体可能发生了氧化损伤，机体抗氧化系统平衡遭到破坏[24]。当机体氧化应激第一道防线被突破，过多的ROS开始攻击DNA生物大分子，引起DNA损伤。氧化应激通过核因子κB激活产生炎症因子并发生炎症 反应[25]。因此本研究采用自由基清除能力突出的PSG干预AA毒性作用，并进行肝脏组织病理观察，测定血清AST、ALT、ALP活力、TG浓度等肝脏功能指标，机体氧化与抗氧化系统状态，及相关免疫因子评价AA诱导的肝脏损伤情况。肝损伤组织病理学特征表明，与模型组大鼠相比，PSG处理缓解了AA诱导的肝细胞损伤。AA可以促进自由基产生并诱导肝组织损伤[26]。动物造模后各项肝功能指标均与正常组差异显著（P＜0.01、P＜0.05），提示肝损伤模型成功。进一步评价机体氧化/抗氧化系统发现，AA处理后机体内产生过量ROS，抗氧化系统紊乱，主要表现为抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）活力极显著降低（P＜0.01）和脂质过氧化产物（MDA）含量极显著升高（P＜0.01），最终导致肝脏发生氧化损伤，这与Yu Rongmin等[27]的研究结果相一致。在氧化损伤情况下，ROS攻击生物大分子并促使机体产生炎症因子。本实验中，AA处理后大鼠体内促炎因子IL-1β质量浓度极显著上升（P＜0.01）。

PSG良好的生物功能与其化学结构密不可分。本课题组前期研究中，PSG具有良好的体外抗氧化活性，这可能主要归因于其中的酚类和蛋白质成分[28]。文献[29]报道，真菌提取物中常见的酚类化合物，如酚酸类、酚类衍生物具有良好的抗氧化活性。酚类物质的抗氧化活性可认为是氢在氧化反应中充当了H－或者电子供体的角色，最终终止氧化电子反应链[30]。另外，抗氧化活性多肽或蛋白中典型的氨基酸包括亲核含硫氨基酸、芳香族氨基酸、咪唑氨基酸等组分也在PSG中发现[12]。进一步探讨其与免疫活性的关系发现，PSG免疫活性与其蛋白质、总酚、中性糖含量均无明显关系，但与糖醛酸含量呈现线性关系，其中酸性β-(1→3,1→6)-葡聚糖结构对PSG发挥免疫活性具有关键性作用。

4 结 论

综上所述，作为天然活性产物来源，PSG可以提高AA诱导肝损伤大鼠体内抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px） 活力，降低促炎因子（IL-1β）、提高抗炎因子（IL-10）质量浓度，一定程度地恢复肝脏功能和修复组织病理损伤。PSG对AA诱导的大鼠肝脏损伤具有保护作用，作用机制可能与其酚类蛋白成分的抗氧化作用和酸性β-(1→3,1→6)葡聚糖结构的免疫调节有关。上述研究对于治疗或早期预防AA毒性具有重要的理论意义和实践价值，也能为膳食营养提供科学指导和实验依据，同时也为以PSG为原料的高附加值产品的开发提供积极的影响。