滇重楼根可培养内生细菌多样性分析及促生菌筛选

耿红，裴婷，苗莉云，甘喆 ，刘婷，张鹏*

(1 中南民族大学 生命科学学院,武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉430074；2 山西中医药大学 基础医学院，晋中 030619)

植物内生菌(endophyte)是指某一段生活史或者全部生活史存在于宿主植物的健康组织和器官中，而通常不会引起疾病明显症状的微生物. 内生菌可影响宿主植物的生长发育，有研究表明，内生菌可以促进天麻种子的萌发[1]、地黄的生长[2]. 内生菌也可促进药用植物有效成分的合成，比如一些内生菌能促进党参中多糖的积累[3]、苍术中香精的积累[4]. 植物内生菌作为一个潜在的资源宝库，日益受到人们的重视.

重楼是我国传统中药材，具有治疗蛇毒以及抗肿瘤作用. 目前关于重楼内生菌的研究极少. Yang等[5]分析了不同栽培年限的滇重楼根中内生菌的多样性，发现8年生根中内生细菌多样性低于4年和6年生，而内生真菌多样性高于4年和6年生. 王茜等[6]分析了云南3个县野生滇重楼的749株内生真菌，发现样地生境和组织部位影响内生真菌的多样性.

本文通过对道地产区滇重楼根部内生细菌的分离及其多样性进行分析，初步揭示滇重楼根组织的内生细菌的菌群结构及其优势类型，并进一步通过与小麦幼苗的共培养，筛选促生菌，为后期深入分析重楼不同组织的内生菌的结构特征以及利用促生菌改良重楼种苗繁育技术的研究奠定基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

滇重楼植株材料于2018年4月采集自中国云南省丽江市区古城区七河镇万农生物科技有限公司的种植基地. LA培养基和牛肉膏蛋白胨培养基用于内生细菌的分离，LB培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基用于内生细菌扩大培养，1/2PDA培养基用于共培养实验，培养基组成和配制方法参照于鹏飞[7]的方法. T5 super Mix Kit购自武汉擎科. 27F和1492R引物序列参照文献[8]，由奥科鼎盛合成.

1.2 植物样品的处理及内生菌的分离

(1)自来水洗掉滇重楼根表面的泥土，削除外皮. (2)无菌水冲洗1遍，1% NaClO溶液浸泡2 min，无菌水冲洗3次，75%乙醇浸泡2 min，无菌水浸泡3次(2 min/次)(取最后一次浸泡材料的水，涂布平板，检测消毒效果). (3)无菌条件下切取0.1 g根，加入1 mL无菌水轻柔研磨. (4)适当稀释后，涂布在分离培养基上，28 ℃培养7 d，并根据细菌生长情况，挑取新长出的菌株至新的培养基，之后，通过划线法纯化获得各个内生细菌的单克隆.

1.3 内生细菌的多样性分析

将各内生细菌分别接种到5 mL LB培养基，28 ℃培养24～48 h后，取0.5 μL菌液做模版，采用T5 Super Mix以及27F和1492R引物扩增各个内生细菌的16S rDNA序列，PCR条件为：95 ℃ 10 min；93 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35个循环；72 ℃、10 min. 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，由奥科鼎盛进行测序.

各内生细菌的16S rDNA序列分别进行BLAST比对分析，确定其分类，再用Mega 7进行序列相似性分析，以Neighbor-joining方法构建系统发育树[9].

1.4 促生菌的筛选

(1)分别取5 μL各个内生细菌的新鲜培养物，均匀涂布于1/2PDA培养基；(2)小麦种子经75%乙醇表面消毒3 min，无菌水浸洗5次(2 min/次)，无菌滤纸吸干水分后，接入涂布有内生细菌的培养基上；对照接种于没有涂布内生菌的培养基；(3) 28 ℃共培养7 d后，测量小麦幼苗的株高、根长、茎粗. 将株高增长30%、根长增长30%或茎粗增长10%的内生细菌定义为促生菌. 每个实验5个生物学重复，随机取其中20株小麦幼苗进行数据测量并取平均值.

2 结果与分析

2.1 内生细菌的分离及多样性分析

采用两种培养基从0.1 g滇重楼根中共分离获得228株内生细菌，经16S rDNA序列分析，这些内生细菌归属于4个门(放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门)，其中变形菌门为优势门(74.12%)；5个纲(微球菌纲、黄杆菌纲、芽孢杆菌纲、γ-变形菌纲、变形菌纲)，其中γ-变形菌纲为优势纲(63.60%)；7个目(微球菌目、黄杆菌目、芽孢杆菌目、伯克氏菌目、肠杆菌目、假单孢杆菌目、黄色单胞菌目)，其中假单孢杆菌目为优势目(40.35%). 11个科(节杆菌科、黄杆菌科、类芽孢杆菌科、葡萄球菌科、芽孢杆菌科、产碱菌科、耶尔森菌科、肠杆菌科、欧文菌科、假单胞杆菌科、黄色单胞菌科)，其中假单胞杆菌科为优势科(40.35%)；13个属，其中假单胞菌属(40.35%)和芽孢杆菌属(22.37%)为优势属(图1，2).

2.2 促生菌的筛选

分别将228株内生细菌与小麦幼苗共培养7 d，发现171株内生细菌导致与其共培养的小麦幼苗死亡或生长缓慢，57株内生细菌的共培养小麦幼苗可以正常生长. 通过测量共培养7 d的小麦幼苗的株高、根长、茎粗，发现10株内生细菌对小麦幼苗的生长有明显的促进作用(表1). 其中，YNR32016(肠杆菌属)、YNR32067(沙雷氏菌属)、YNR32084(沙雷氏菌属)对小麦株高促进效果较好，与对照(9.69±1.4 cm)相比，株高增长率分别为72.43%、71.24%、53.14%. 对小麦根长促进效果尤为明显的是YNR32041(产碱菌属)、YNR32084(沙雷氏菌属)、YNR32052(类香味菌属)，与对照(2.8±0.4 cm)相比，根长增长率分别为602.51%、354.12%、328.57%. 对小麦茎粗促进效果较好的3株菌株为YNR32046(芽孢杆菌属)、YNR32045(类香味菌属)、YNR32052(类香味菌属)，与对照(1.85±0.43 mm)相比，茎粗增长率分别为26.87%、23.62%、19.58%. 该结果也表明，不同属的菌株对小麦幼苗同一组织的促生作用不同，预示不同属的内生菌对植株同一组织的促生机制或促生能力存在差异. 同时，该结果也表明同一个菌株对小麦不同组织的促进效果不同，因此，要想实现利用内生菌促进植株特定组织的生长，必须先针对性地筛选促进该组织生长的特定菌株.

A～C分别为共培养4 d的对照、YNR32016、YNR32067的生长情况；D～F分别为共培养7 d的对照、YNR32016、YNR32067的小麦幼苗图3 滇重楼根内生细菌与小麦共培养Fig.3 Co-cultivation of endophytic bacteria isolated from P. polyphylla var.yunnanensis roots with wheat seedlings

表1 滇重楼根内生细菌对小麦的促生作用Tab.1 The promoting effect of endophytic bacteria of P. polyphylla var.yunnanensis on wheat seedlings

3 讨论

内生菌的多样性或其群体结构影响宿主植物的药用物质的合成[10]. 目前，关于药用植物内生菌研究已有报道. 阳湖荣等[11]从一年生白术的1.0 g根组织中共分离到49株内生细菌，这些内生细菌归属到11个属，其中优势属为芽孢杆菌属(46.94%). 廖秋红等[12]从6年生滇重楼根组织中共分离到22株内生细菌，可归属到9个属. 本研究从5年生滇重楼的0.1 g根中共获得228株内生细菌，可归属到13个属，其中假单胞菌属和芽孢杆菌属为优势属，预示芽孢杆菌属、假单胞菌属内生菌可能对重楼根中药用成分的合成有较大的影响. 本研究分析的5年生滇重楼根与廖秋红等[12]分析的6年生滇重楼根都含有5个属(葡萄球菌属、变形菌属、产碱菌属、寡养单胞菌属、微杆菌属)的内生细菌. 但本研究的5年生滇重楼根中内生细菌的9个属(类香味菌属、类芽孢杆菌属、芽孢杆菌属、沙雷氏菌属、肠杆菌属、假单胞菌属、克雷伯氏菌属、Lelliottia、泛生菌属)，与廖秋红等[12]报道的6年生滇重楼根中内生细菌的4个属(表皮葡萄菌球菌属、无色杆菌属、嗜麦寡养单胞菌属、鞘氨醇杆菌属)存在差异，这可能与研究所用滇重楼植物材料的生长年限以及采集地区有关.

许多内生菌具有促进植物生长、种子萌发以及抗菌和抑菌的作用，例如Mishra等[13]从药用植物天竺葵植株中分离得到2株具有促生长活性的内生细菌. 宋发军等[14]发现重楼内生细菌可以促进冬小麦的种子萌发. 许多植物内生菌还具有许多抗菌和抑菌作用，艾洪莲等[15]发现篮状菌属 (Talaromyces) 、毛壳菌属 (Chaetomium) 和附球菌属 (Epicoccum) 内生真菌对马铃薯枯萎病、黑痣病和早疫病有明显拮抗作用.

本研究分别将228株内生细菌与小麦幼苗共培养，初步筛选获得10株促进小麦生长的内生细菌，为进一步利用促生菌改良重楼种苗繁育技术的研究提供了菌株资源，同时，没有促生作用的菌株也为后期筛选具有抗菌和抑菌作用的微生物提供了资源.