GATA6和STAT4在乳腺癌组织中的表达及临床意义

黄蓉飞 段锦华 樊元春 王晓燕

乳腺癌是女性群体中较为常见的恶性肿瘤，近年来，其发病率和死亡率均呈增加趋势，严重危害患者健康。及时诊断和治疗是降低患者死亡率的关键措施。随着分子生物学的快速发展，肿瘤标记物已被用于肿瘤的诊治和预后判断。GATA6是进化保守的转录调节因子，与细胞的多种生物学行为相关。GATA6在胃癌、胆管癌、结肠癌等多种肿瘤中异常表达，与肿瘤发生、发展以及患者预后不良密切相关[1-3]。研究发现，GATA6可通过JAK/信号通路和调控信号传导和转录激活因子(STAT)参与肿瘤发展过程[4]。STAT家族是能与DNA结合的蛋白质，介导多种细胞因子和生长因子向细胞核内传导，影响靶基因的转录，调控细胞功能[5-7]。研究发现，STAT家族重要的成员STAT4与一些肿瘤的发生发展关系也十分密切[8]。但是，GATA6和STAT4在乳腺癌中的作用及机制还不清楚，本研究采用免疫组织化学法检测GATA6和STAT4在乳腺癌中的表达情况，初步探讨二者表达与乳腺癌临床病理特征和患者预后的关系，以期寻找新的肿瘤标志物为乳腺癌的诊治和预后判断提供一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2011年1月至2012年12月本院诊治的79例乳腺癌患者为研究对象，均为女性，年龄41～82岁，平均年龄(60.59±6.73)岁。所有乳腺癌患者术前均未进行任何治疗，完整的临床和病理资料完整。其中鳞癌31例，腺癌27例，其他21例；按照不同分化程度分类，高分化18例，中分化36例，低分化25例；按2009年国际抗癌联盟肺癌分期标准进行TNM分期，其中Ⅰ期17例，Ⅱ期21例，Ⅲ期19例，Ⅳ期22例；有淋巴结转移37例，无转移42例。均行肿瘤切除术，术前未进行放、化疗，术中留取癌组织和对应癌旁组织标本，癌旁组织距离癌组织大于3 cm，经病理分析无癌细胞。本研究经我院医学伦理委员会批准，患者或家属自愿签署知情同意书。

1.2 主要仪器与试剂

GATA6兔抗人多克隆抗体和STAT4兔抗人多克隆抗体均购自上海万疆生物技术有限公司；通用型SP法免疫检测试剂盒够自武汉默沙克生物科技有限公司；DAB 显色盒购于上海酶联生物科技有限公司；医用微波炉购自南京杰全微波设备有限公司；ZYS-170生物显微镜购自上海兆仪光电科技有限公司；无水乙醇、过氧化氢、枸橼酸等均为国产分析纯。

1.3 免疫组化染色与结果判断

取乳腺癌癌组织和癌旁组织切片，厚度4 μm，常规脱蜡处理，梯度乙醇水化，3%过氧化氢灭活内源性氧化酶，微波抗原修复。清洗后，封闭10 min，滴加一抗，4 ℃孵育12 h。孵育后洗涤，先后滴加生物素标记的二抗和辣根酶标记链酶卵白素，4 ℃各孵育20 min。孵育后PBS洗涤，滴加DAB显色液染色5 min，之后经冲洗、苏木精复染、脱水、封片后置于显微镜下进行观察。随机挑选切片中的高倍视野，统计阳性染色细胞数量。①按阳性细胞所占的百分比计分为<5%(0分)、5%～25%(1分)、26%～50%(2分)、51%～75%(3分)和>75%(4分)。②按染色强度计分为无色(0分)、淡黄色(1分)、棕黄色(2分)和棕褐色(3分)。两项结果乘积大于3分时记为阳性表达，否则为阴性表达。

1.4 随访观察

对所有乳腺癌患者进行随访，随访时间为5年，截止至2017年11月，死亡患者以死亡时间作为随访截止期。记录患者随访期间患者的生存情况。

1.5 统计学分析

应用统计学软件SPSS 19.0对数据进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用t检验；计数资料用n表示，采用χ2检验。各组数据均以P<0.05为差异具有统计学意义。利用Kaplan-Meier法计算乳腺癌患者5年存活率，Cox回归模型分析影响患者预后因素。

2 结果

2.1 GATA6和STAT4蛋白表达情况

癌旁组织中GATA6和STAT4阳性表达率分别为15.19%、10.13%，乳腺癌组织中GATA6和STAT4阳性表达率分别为64.56%、62.03%。与癌旁组织相比，乳腺癌组织中GATA6和STAT4阳性表达率均显著升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 GATA6和STAT4表达情况/例

2.2 GATA6和STAT4在乳腺癌中的表达与其临床病理特征的关系

在乳腺癌组织中GATA6和STAT4表达均与肿瘤分化程度、TNM分期以及淋巴结转移相关(P<0.05)，而与患者年龄、肿瘤大小、肿瘤病理分型无关(P>0.05)，见表2。

2.3 GATA6和STAT4相关性分析

乳腺癌患者中，38例GATA6和STAT4二者均为阳性患者，17例GATA6和STAT4二者均为阴性患者，13例GATA6阳性STAT4阴性患者，11例GATA6阴性STAT4阳性患者。Spearman等级相关分析结果显示，二者在乳腺癌中的表达呈显著正相关(γ=5.613，P<0.05)。结果如表3所示。

表2 GATA6和STAT4在乳腺癌中的表达与其临床病理特征的关系/例

表3 GATA6和STAT4在乳腺癌组织中表达情况/例

2.4 GATA6和STAT4与患者生存率的关系

采用Kaplan-Meier法分析乳腺癌患者5年存活率，结果如图1所示。GATA6和STAT4阳性表达患者5年生存率分别为46.06%、51.02%，GATA6和STAT4阴性表达患者5年生存率分别为67.86%、73.33%。GATA6和STAT4阳性表达患者5年存活率较对应阴性表达患者均降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

A为GATA6表达对患者生存期影响，B为STAT4表达对患者生存期影响。

2.5 Cox分析影响乳腺癌患者预后因素

Cox回归模型分析结果显示：GATA6、STAT4、TNM分期和淋巴结转移均是影响乳腺癌患者预后的独立因素，见表4。

表4 影响乳腺癌患者预后因素的Cox分析

3 讨论

乳腺癌是女性恶性肿瘤中常见的疾病，中国乳腺癌的发病率和死亡率均逐年上升，已成为当前社会的主要公共卫生问题。所以，寻找有效的方法提高乳腺癌患者的生存率或存活期尤为重要。目前，主要依据肿瘤大小、病理组织学分级以及淋巴结转移状况等指标判断乳腺癌的病程以及预后[9]。随着分子生物学的快速发展，分子生物学领域的研究已成为当今乳腺癌研究的重点和热点，并取得了一定的成绩。肿瘤标记物已被用于肿瘤的诊治和预后判断。

GATA6是GATA转录因子家族成员，具有高度保守的锌指结构，能够识别GATA序列并与之结合，在组织发育中起着关键的调节作用[10]。GATA6在不同肿瘤组织中的生物学作用不同，受到越来越多的关注。Martinelli等[11]研究发现，GATA6能间接能抑制上皮细胞的间质转化(EMT)，间接调控EMT中涉及的其他转录因子，在胰腺导管腺癌中起抑癌因子作用。GATA6低表达的胰腺导管腺癌患者存活期较短，是患者治疗疗效和预后判断的重要参考指标。Fantini等[12]研究发现GATA6参与肠上皮细胞稳态和分化，在结肠癌患者中蛋白阳性表达增加，通过Wnt /β-catenin途径发挥促癌作用。然而，GATA6在乳腺癌中的作用和潜在机制仍不清楚。本研究通过免疫组化法检测乳腺癌组织中GATA6表达，结果发现GATA6在乳腺癌组织中阳性表达较癌旁组织升高，且其表达与肿瘤分化程度、TNM分期以及淋巴结转移相关，与Song等[13]研究结果一致，提示GATA6作为促癌因子参与乳腺癌的发展过程。GATA6阳性表达患者5年存活率低于阴性表达患者，是乳腺癌预后的独立危险因素，提示GATA6可作为乳腺癌预后判断的参考指标。

生物信息学分析发现，GATA6可能是STAT4的上游调控分子。STAT4是 STATs 蛋白家族中的惟一1个限定组织分布的蛋白，主要分布在淋巴和髓系组织中，由IL-12诱导的反应所激活[14]。在IL-12作用下，STAT4诱导Th0细胞向Th1细胞方向分化并产生Th1类细胞因子IL-2 和IFN-γ，Th1 /Th2 平衡失调与肿瘤的发生和发展及预后关系密切[15]。研究发现，黄腐酚可能通过促进STAT4的活化，调节Th1/Th2平衡向Th1促进机体抗肿瘤免疫[16]。Zhao等[17]研究发现，STAT4是卵巢癌转移的关键转录因子，活化的STAT4在卵巢癌的上皮细胞中过表达，并且STAT4过表达与卵巢癌患者的不良结果相关，可能通过癌-基质相互作用介导EMT过程，促进了卵巢癌的转移。辛彩霞等[18]研究发现STAT4在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达均高于正常肺组织，且与肿瘤分化程度相关，提示其在NSCLC的发生发展过程中发挥了重要作用。但是，STAT4在乳腺癌中的表达是否异常还不清楚。本研究结果显示，STAT4在乳腺癌组织中阳性表达率较癌旁组织升高，其高表达与肿瘤低分化程度、高TNM分期以及淋巴结发生转移密切相关，提示STAT4在乳腺癌的发生和发展过程发挥促癌因子的作用。Cox回归分析结果显示，STAT4是乳腺癌预后的独立影响因素，且STAT4阳性表达患者5年存活率较阴性表达患者低，提示STAT4对乳腺癌的预后判断具有重要参考价值。相关性分析结果显示，GATA6和STAT4表达呈明显正相关，两者与乳腺癌临床病理特征的关系具有一致性，GATA6可能通过STAT4途径或调控STAT4共同参与乳腺癌的发展过程，有待因一部深入研究。

综上所述，乳腺癌组织中GATA6和STAT4表达阳性表达均显著升高，与肿瘤分化程度、TNM分期以及淋巴结转移等临床病理特征关系密切，两者阳性表达患者存活率均显著低于阴性表达患者，是影响乳腺癌预后的独立因素，表明其参与乳腺癌的发生和发展过程，可做为患者预后判断的重要参考指标。深入研究GATA6和STAT4在乳腺癌中的作用机制，将会为乳腺癌的诊治提供新的靶点。