串联的纳米传感器用于癌细胞中miRNA的超灵敏检测

陈蜜　岳仁叶　李智　王刚林　马楠

摘 要 MicroRNA（miRNA）的检测在癌症诊断和治疗中具有重要意义。本研究设计了DNA序列，组装了3组金纳米粒子-量子点复合物， 基于此叠加构建了以熵驱动催化循环为模型的单重、双重和多重循环放大的3种纳米传感器。叠加的传感器中，上层复合物催化循环解组装输出的产物作为下层复合物的催化链，引发其解组装，释放更多荧光信号，实现了多重放大。传感器中每叠加一个核酸催化循环体系，检测限降低一个数量级，最终构建的传感器的检测限达到fmol/L级。本研究通过串联熵驱动的核酸催化循环体系，构建了动态可调的、可定量检测细胞中不同表达水平miRNA的新型纳米传感器。

关键词 miRNA; 金纳米粒子; 量子点; 核酸循环; 荧光检测

1 引 言

MicroRNA（miRNA）是一类内源性的小尺寸的非编码RNA分子，长度约为18～25个核苷酸[1～4]。miRNA主要通过与靶基因mRNA配对引导沉默复合体，降解mRNA或阻碍mRNA的翻译[5]。miRNA不仅在生物调节途径中起重要作用[6]，也参与肿瘤的发生、发展等病理過程[7]。miRNA的异常表达与癌症的发生密切相关，被认为是诊断癌症的重要生物标志物[8～12]。然而，miRNA序列的高度同源性、尺寸小以及在生物体内含量低等特点[13]，使癌细胞中miRNA的精准、灵敏检测极具挑战性。在过去的十几年中，研究者开发了很多技术以提高检测miRNA的灵敏度[14～17]，如定量逆转录-聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术能灵敏地定量检测低表达的miRNA[17，18]，但该方法的仪器设备昂贵且耗时长。

近年来，作为一种有效的信号放大策略，核酸循环为检测低浓度目标物提供了一个重要的技术平台[19，20]。Yin等[21]采用双链特异性核酸酶剪切与miRNA杂交的分子信标放大荧光信号，但核酸酶并不能普遍适用于复杂的生物环境体内; Wu等[22]利用两个发夹DNA间循环催化反应检测细胞内低表达的mRNA，一个靶目标分子经过发夹DNA循环反应后，输出多个荧光信号，但荧光染料光学性能的局限性影响了方法灵敏度。

金纳米粒子（GNP）具有比表面积大、生物相容性好和毒性低等特性，可作为载体将核酸运输至细胞内[23，24]，并且对荧光基团有很好的淬灭能力[25]。与传统的荧光染料相比， 量子点（Quantum dots， QDs）具有发射波长可调节、量子产率高、光稳定性好等优点，被广泛应用于生物传感、生物成像领域[26～29]。 Ma等[30]以DNA为模板一步合成生物功能化的水相碲化镉量子点（CdTe QDs），简化了QDs生物功能化的步骤，为构建基于QDs的纳米传感器提供了参考。 Ma等[31]报导了以熵驱动核酸催化循环[32]为模型构建的GNP和QDs组装的纳米传感器，检测细胞内miRNA，检出限达到pmol/L级。尽管对于提高检测miRNA灵敏度的研究取得了一些进展[33，34]，但不同癌细胞中miRNA表达水平差异显著，常规传感器的检测限和线性检测区间限制了其在定量分析miRNA中的实际应用。

本研究通过合理设计DNA序列，组装了3组金纳米粒子-碲化镉量子点复合物（GNP-QDs composite， GQC），并依次叠加构建了以熵驱动催化循环为模型的单重、双重和多重循环放大的3种纳米传感器。叠加的传感器中，上层GQC催化循环解组装输出的产物作为下层GQC的催化链，引发其解组装，释放更多荧光信号，实现QDs荧光信号的多重放大。通过叠加多个催化循环体系[35]调控传感器的线性检测区间，降低检测限，用于定量检测不同细胞内不同表达水平的miRNA。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

FE20K酸度计（美国Mettler Toledo公司）; AvaSpec-ULS2048-USB2 荧光光谱仪（荷兰Avantes公司）;  Tecnai G2 F20 S-Twin透射电镜 （美国FEI公司）;  Agilent 8453 紫外-可见分光光度计（美国 Agilent 公司）; GelDoc-It 310 UVP 凝胶成像仪（美国 UVP 公司）; Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳装置（美国 Bio-Rad 公司）; DYCP-31DN琼脂糖水平电泳仪（北京六一仪器厂）; Infinite M200 PRO多功能酶标仪（美国TECAN公司）; Nano ZS90 激光粒度仪（英国 Malvern 公司）; Olympus IX71 倒置荧光显微镜（日本 Olympus公司）。

氯化镉（CdCl2， 99.99%）、谷胱甘肽（GSH， 98%）、碲粉（Te， 99.99%）、硼氢化钠（NaBH4， 98%）、氯金酸（HAuCl4·3H2O， 99.9%）均购自Sigma-Aldrich公司; 琼脂糖（Agrose，99%）购自Biowest公司; 柠檬酸钠（99%）购自百灵威公司; 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、过硫酸铵（APS）、MgCl2、NaCl、NaOH、乙酸（HAc）、HNO3、无水甲醇（CH3OH）均至少为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司;  HCl购自强盛功能公司; 聚丙烯酰胺（40%）、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED，98%）、甘油（99.0%）购自北京索莱宝公司; 二硫苏糖醇（DTT， 99%）、6-巯基-1-己醇（MCH， 98.0%）购自阿拉丁试剂公司; 三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP，98.0%）购自TCI公司; HeLa细胞系购自中国典型培养物保藏中心; 22Rv1细胞系购自上海生物科学研究院细胞资源中心; DMEM培养基、RPMI 1640培养基、1×PBS缓冲溶液、胎牛血清、胰蛋白酶均购自Hyclone公司; miRcute miRNA分离试剂盒购自Tiangen Biotech公司。巯基修饰（Thiolated）DNA购自Takara公司; 荧光染料修饰的DNA购自上海生工生物工程有限公司;硫代DNA以及其它未修饰DNA（序列见表1）购自IDT公司。实验用水为超纯水（Milli-Q Direct8 超纯水系统，美国Millipore公司）。

2.2 实验方法

2.2.1 以硫代DNA为模板一步合成CdTe QDs

按文献＼[30＼]的方法，用Te和NaBH4制备Te离子的前驱液; 以GSH为配体，与CdCl2配制Cd离子前驱液，与硫代DNA混合后加入Te离子前驱液， 混匀后在100℃下反应，可一步合成DNA4修饰CdTe QDs（Q1）、DNA5修饰CdTe QDs（Q2）和DNA6修饰CdTe QDs（Q3）。用30 kD离心超滤管离心超滤（12500 r/min， 3 min）两次，重新分散于水中。根据文献＼[36＼]方法计算浓度。

2.2.2 GNP的合成以及表面DNA的修饰 采用柠檬酸还原法合成约13 nm的GNP[32]，用 0.22 μm微孔滤膜过滤，紫外可见分光光度计测定520 nm处吸光度， 并计算GNP的浓度（摩尔吸光系数为2.7×108 L/（cm·mol）。  在巯基DNA1、 DNA2和DNA3中加入TCEP， 孵育2 h， 将GNP和巯基DNA按1∶80的摩尔比例混合，37℃恒溫摇荡1 h后离心，加入柠檬酸钠-盐酸缓冲溶液（pH 3），摇荡1 h，12500 r/min离心7 min，分散在1×PBS中，得到GNP -DNA1（G1）、GNP-DNA2（G2）和GNP -DNA3（G3）。

2.2.3 GQC的组装 将G1与L1按摩尔比1∶60混合，加入NaCl（终浓度50 mmol/L）和MgCl2（终浓度2.5 mmol/L），于37℃反应过夜，12000 r/min离心6 min，分散在1×PBS缓冲液中。将组装好的G1-L1与Q1按照GNP与QDs摩尔比为1∶60混合，加入NaCl（终浓度50 mmol/L）和MgCl2（终浓度2.5 mmol/L） 37℃反应3 h，缓慢降至室温。12000 r/min离心7 min，分散于1×PBS缓冲液中，得到复合物GNP-QDs1（GQC1）。按同样步骤，分别通过L2和L3将G2和Q2、G3和Q3组装成GQC2和GQC3。

2.2.4 GNP修饰DNA数量的测定 将序列与DNA1一致的FAM-DNA1按照2.2.2节的步骤修饰在GNP表面，取100 μL FAM-DNA1-GNP（36.5 nmol/L）与80 μL DTT（10 mmol/L）混合，振荡12 h，14000 r/min离心5 min，收集上清液，酶标仪测定荧光强度，激发波长480 nm，发射波长520 nm。酶标仪测定浓度分别为10、20、30、40和50 nmol/L 的FAM-DNA1荧光强度，绘制标准曲线，通过标准曲线计算GNP表面连接的FAM-DNA1的浓度，与GNP浓度的比值即为GNP表面修饰DNA1的数量。GNP表面修饰的DNA2和DNA3的数量按照以上方法测定。

将与L1序列一致的FAM-L1与G1按照2.2.3节组装，测定GNP连接的L1条数。采用同样方法测定和计算GNP表面连接的L2和L3的数量。

2.2.5 纳米复合物特异性测试

用1×PBS缓冲液配制一系列含5 nmol/L GNP 的GQC1溶液，并与 F1（终浓度60 nmol/L）混合，加入miR-21（终浓度为100、10、2、1、0.2、0.1和 0 nmol/L）; 对照组（C' control）的GQC1中加入终浓度为100 nmol/L miR-141和 60 nmol/L F1， 37℃反应6 h，12000 r/min离心3 min，取上清液测荧光信号。

2.2.6 纳米传感器的构建和循环检测DNA 由GNP浓度为5 nmol/L GQC1构建传感器C1;  由GNP浓度均为5 nmol/L GQC1和GQC2混合（即串联），构建传感器C2; 由GNP浓度分别为5、5和10 nmol/L的 GQC1、GQC2和GQC3混合，构建传感器C3。

在3组传感器C1、C2和C3中加入对应的fuel DNA（终浓度分别是60 nmol/L F1; 60 nmol/L F1和60 nmol/L F2; 60 nmol/L F1、60 nmol/L F2和120 nmol/L F3），加入靶分子C'至终浓度分别是100、10、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005、0.002、0.001和0 nmol/L，在37℃分别反应6、8和12 h。离心，测定上清液荧光信号，下层沉淀用1×PBS缓冲液分散后，进行琼脂糖凝胶电泳分析。

2.2.7 固定细胞成像 在48孔板中接种HeLa细胞和22Rv1细胞，每孔细胞数约2×104个，在细胞培养箱中37℃孵育24 h。弃去培养液，细胞用甲醇固定，加入传感器C1、C2和C3以及相应的Fuel DNA，培养箱中37℃孵育6、8和12 h，用1×PBS缓冲液清洗细胞，采用荧光倒置显微镜成像。

2.2.8 提取RNA定量检测miRNA 在细胞培养瓶中分别接种HeLa细胞和22Rv1细胞，待2种细胞长满培养瓶后，采用试剂盒提取细胞的总RNA，测量总RNA在260 nm处的吸光度（1 OD=40 ng/μL RNA）。将提取的RNA稀释，与相应FuelDNA混合后加入对应的传感器中，测定荧光光谱，计算荧光恢复率，并根据线性曲线计算miR-141在两种细胞中的表达量。

3 结果与讨论

3.1 QDs和GNP组装和表征

DNA功能化CdTe QDs的吸收光谱和荧光谱如图1A所示， QDs的最大吸收峰位于571 nm（曲线a），最大发射波长为627 nm（曲线b）， 计算QDs的量子产率为17.6%[32]。采用透射电镜和高分辨透射电镜对QDs进行表征（图1B）， QDs直径为（3.43±0.18） nm。QDs进行凝胶电泳图谱见图1C，QDs表面大多修饰了一条DNA链。

GNP电镜表征图如图2A所示，其直径为（15.48±0.23） nm。使用DTT法测得每个GNP表面修饰了36条巯基DNA和20条Linker DNA。琼脂糖电泳表征图（图2B）和电镜表征图（图2C）都表明GNP和QDs形成了组装体，且每个GNP表面组装了约12个QDs[32]。

3.2 串联传感器的构建以及可行性验证

本研究以熵驱动核酸催化循环为模型构建纳米传感器，实现检测信号的放大。在传感器C1中，Q1通过L1与G1组装成GQC1，由于荧光共振能量转移作用，Q1的荧光被G1猝灭，miR-141作为GQC1的靶分子，进攻作用位点Toehold 1，将G1取代，由于G1与Q1距离增大，不能发生荧光共振能量转移，Q1的荧光信号恢复。同时，作用位点Toehold 2暴露，F1与之结合，将Q1从组装中取代出来，同时又置换出miR-141，miR-141继续进攻下一个作用位点Toehold 1，释放Q1，如此循环下去，一个靶目标循环解组装GQC1输出多个Q1荧光信号（图3A）。将GQC1和GQC2按1∶1比例叠加构建传感器C2，miR-141作为靶向物催化解组装GQC1中置换出的Q1作为GQC2的催化链，与F2通过Toehold 3和Toehold 4两作用位点，按照上述循环方式继续催化解组装GQC2，释放Q2。如此，在传感器C2中输入一个靶目标分子，能够输出多个Q1和Q2的荧光信号;  将GQC1、GQC2和GQC3按1∶1∶2比例叠加构建传感器C3，GQC2中被Q1催化解组装输出的Q2又作为GQC3的催化链，与F3通过Toehold 5和Toehold 6两作用位点催化解组装GQC3，释放Q3，如此，在传感器C3中，输入一个靶目标能够输出多个Q1、Q2和Q3的荧光信号（图3B），检测靶目标miR-141对应的荧光信号，得到多重放大。

采用凝胶电泳表征单链DNA间杂交、链取代反应，以验证该实验设计的可行性。如图4所示，泳道g对应在GQC2的单链组装体加入对应的催化链（DNA4）和F2后解组装的条带;  泳道h对应将GQC1和GQC2的单链组装体1∶1串联，只加入了GQC1的靶目标（0.05×C'）和F1和F2的情况; 泳道h中同样也出现了GQC2单链组装体解组装的条带， 并且条带的荧光强度比泳道g中的条带的荧光强度高，表明将核酸循环串联可实现信号的多重放大。

考察了GQC1对miR-141的特异性响应。将miR-21按照与L1（100 nmol/L）摩尔比分别为1、0.1、0.02、0.01、0.002、0.001和0的比例，与F1加入至C1传感器中，与对照组（C' control）相比，GQC1的荧光强度基本没有变化（图5），即没有QDs被miR-21从GQC1解组装出来，表明此复合物可特异性识别miR-141。

3.3 串联传感器循环检测miRNA

探究3组传感器C1、C2和C3对不同浓度的靶向物C'（miR-141）的响应能力，将与L1（100 nmol/L）不同摩尔比（1、01、002、001、0005、0002、0001、00005、00002、00001、000005、000002、000001和0）的C'和對应的Fuel加入至C1、C2和C3传感器中，采用琼脂糖电泳和荧光光谱表征复合物解组装的程度。

如图6所示，随着C'/L1的比例不断增加， 复合物解组装越完全，在泳道中迁移速率越快。传感器C1、C2和C3分别对在0001～1、00001～1和000001～1（C'/L1摩尔比）范围内对靶向物有响应。随着核酸循环体系的叠加，对应的传感器的灵敏度也随之提高，可响应的靶向物浓度更低。因此，可通过改变叠加的循环体系的数量调控靶向物检测范围。

图7A～7C是由不同比例的C'/L1分别滴定C1、C2和C3传感器释放的QDs的荧光谱图，在不同C'/L比例下传感器解组装释放的QDs荧光强度与琼脂糖电泳表征的解组装结果基本一致。图7D为3组传感器中QDs荧光恢复率（F/F0-1）与不同比例C'/L1的关系图， 根据图7D将3组传感器检测的C'/L1摩尔比例区间转化为C'浓度区间，其中C1为10-10～10-7 mol/L，C2为10-11～10-7 mol/L，C3为10-12～10-7mol/L，可见每叠加一个核酸催化循环体系，其对应的传感器最低检测范围降低一个数量级。

根据图8中3组传感器的线性检测曲线，计算C1、C2和C3的检测限分别为47.3 pmol/L、4.23 pmol/L和552 fmol/L（3σ/k）。

3.4 固定细胞成像

miR-141在22Rv1细胞中表达含量高， 在HeLa细胞中表达含量较低[21，37]。将C1、C2和C3传感器和对应的Fuel与上述两种固定细胞分别孵育6、8和12 h后的细胞荧光成像图如图9所示， 22Rv1细胞与3组传感器孵育后均有明显的荧光成像信号， 并随着每一次核酸循环体系的叠加， 荧光信号强度也随之增强; C1传感器在HeLa细胞中并没有明显的QDs荧光成像信号，这是因为HeLa细胞中miR-141表达含量比较低[38]， 其含量低于C1传感器检测限。选取相应的传感器定量检测两种细胞中miR -141的含量（表2），并与文献对比发现，提取RNA定量检测miR -141的拷贝量与文献报导的值相接近[21，37～39]。

4 结 论

通过将核酸循环体系叠加，开发了新型纳米传感器，与常规的纳米传感器相比，串联的纳米传感器具有动态可调的线性检测区间和检测限，可用于灵敏检测癌细胞中不同表达水平的miRNA分子。虽然通过串联核酸循环能够放大检测信号，但伴随着信号的放大，传感器的背景信号也随之增大，影响串联传感器的灵敏度的提高。 后续研究将对传感器背景信号增加的原因进行分析，进一步提高串联传感器的灵敏度。

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