调味香料草豆蔻精油的超声-微波辅助提取及其包结物

张怡，李荣*，姜子涛,2

(1.天津商业大学 生物技术与食品科学学院，天津 300134; 2.天津天狮学院 食品工程学院，天津 301700)

草豆蔻(AlpiniakatsumadaiHayata)俗名草蔻，为我国传统的调味香料，是卤制肉制品必不可少的调味香料之一[1,2]。关于草豆蔻的化学成分已有部分文献报道[3-5]，但研究主要集中在黄酮和二苯基庚烷类化合物的分离分析[6-8]，以及提取物的抗肿瘤、抗氧化和抑菌活性[9-12]。目前已报道的草豆蔻精油(AKEO)提取方法有水蒸气蒸馏法、索氏提取法、超临界二氧化碳流体萃取法等[13-15]，以上方法均具有提取时间长、提取效率低等缺点。

本研究采用超声微波辅助协同提取技术提取了AKEO，使提取时间由通常的数小时缩短到几分钟；并通过单因素实验和响应面法确定AKEO提取的最佳条件。为提升AKEO的稳定性，制备了β-环糊精钾有机骨架(K-β-CD-MOF)与AKEO包结物(K-β-CD-MOF-AKEO)。AKEO被包结后减少了与氧气的接触，进而达到了长期存放和缓释的目的，同时也增大了其在加热、强酸或强碱等条件下的稳定性。本文探讨了包结作用机制，对于指导AKEO与K-β-CD-MOF的包结反应，为AKEO的开发及在食品工业中的应用提供了有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

草豆蔻：购于云南，粉碎成约40目备用。β-环状糊精(β-CD)：上海化学试剂采购供应站联营企业中心化工厂；甲醇(分析纯)、无水乙醇：天津市津东天正精细化学试剂厂；无水硫酸钠：天津市科密欧科技有限公司；氢氧化钾：天津市化学试剂三厂；实验用水均为纯净水，利用纯水机自制(上海Heal Force公司)。

U-3900 紫外-可见分光光度计 日本株式会社日立制作所；CW2000超声-微波协同萃取/反应仪 上海新拓微波公司；B203生物光学显微镜 重庆市奥特仪器有限公司；WE-1水浴恒温振荡器 天津市欧诺仪器仪表有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 AKEO的超声-微波协同提取工艺

称取15.0 g草豆蔻粉末于提取瓶中，以蒸馏水为提取溶剂采用微波超声辅助水蒸气蒸馏法提取。提取温度设定为100 ℃，超声功率为50 W(仪器固定)，在一定微波功率、提取时间和液料比下进行提取。蒸馏至无油量增加，收集水面上层精油，使用适量无水硫酸钠去除水分，用0.45 μm有机微孔滤膜过滤后储存于棕色瓶中，放置于4 ℃冰箱冷藏保存。

1.2.2 AKEO超声-微波协同提取单因素实验

1.2.2.1 液料比对精油提取率的影响

固定微波功率600 W，提取时间为7 min，分别设定液料比为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1(mL/g)，收集精油并计算精油提取率(n=3)。

1.2.2.2 微波时间对精油提取率的影响

固定微波功率600 W，液料比为10∶1(mL/g)，微波时间分别设定为4，5，6，7，8 min，收集精油并计算精油提取率(n=3)。

1.2.2.3 微波功率对精油提取率的影响

固定液料比10∶1(mL/g)，提取时间为7 min，分别在微波功率400，500，600，700，800 W 下进行提取，收集精油并计算精油提取率(n=3)。

1.2.3 AKEO提取工艺的响应面优化设计

根据单因素实验结果及Box-Behnken中心实验设计原理，选取微波功率、微波时间、液料比为响应面设计的考察因素并对因素范围进行优化，以精油提取率为响应值，利用Box-Behnken进行响应面优化实验。其中，每个因素3个水平，中心实验重复3次，因素水平设计见表1。

表1 响应面实验因素水平设计Table 1 Factors and levels design of response surface experiment

1.2.4 K-β-CD-MOF的合成

根据参考文献[16,17]中的方法并稍作修改，称取1.300 g β-CD和0.450 g氢氧化钾于小烧杯中，加入20 mL蒸馏水充分搅拌溶解，全部溶解后将烧杯放入装有100 mL无水甲醇的层析缸中密封。于室温条件下静置1周，在此期间甲醇蒸汽缓慢扩散进入溶液，在烧杯中生长出无色立方晶体K-β-CD-MOF，用无水乙醇洗涤3次后干燥即可。

1.2.5 AKEO与K-β-CD-MOF的包结作用

根据参考文献[18]中的方法并稍作修改，在比色管中分别加入2 mL 0.002 mol/L精油溶液(用70%的乙醇配制)，再依次加入0，0.2，0.5，1，2，3，4，5 mL 0.01 mol/L的K-β-CD-MOF溶液，加入适当无水乙醇，再用蒸馏水定容到10 mL，保持乙醇体积浓度为35%，在20～50 ℃下恒温水浴振荡30 min，利用紫外分光光度计测定最大吸收波长处的吸光度值，计算平衡常数及热力学常数。

包结常数(K)采用紫外分光光度法进行测定。可由Hildebrand-Benesi方程得到包结物的K值[19]；依据Van't Hoff方程以及K与标准吉布斯自由能之间的对应关系，计算包结过程的ΔH、△S和△G。

2 结果与分析

2.1 单因素对精油提取的影响

考察了液料比、微波时间及微波功率对草蔻精油提取率的影响，结果见图1。

图1 单因素对AKEO提取率的影响Fig.1 Effect of single factor on extraction rate of AKEO

由图1中a可知，随着液料比的增大，提取率随蒸馏水比例变大先增高后降低，在液料比为10∶1时得到最大值。当液料比过大时，可能是水量的加大使得精油在水中的溶解度增大，导致精油的提取率降低[20]；液料比过小时，易造成原料浸泡不充分，局部过热，使得原料发生炭化[21,22]，造成精油提取率降低。

由图1中b可知，在5～9 min内，精油提取率随时间的增加先升高后降低。当微波时间低于7 min时，随着微波时间的延长，微波辐射对物料细胞的破坏作用呈累积形式增加，对物料进行充分作用[25]，释放出的物质增多造成提取率增加。微波时间过长，可能造成精油氧化或降解等现象，造成提取率降低[26]。因此，微波时间不宜过长，本实验选取7 min进行下一步优化。

由图1中c可知，在一定微波时间和一定液料比下，随着微波功率的升高，提取率先增大后降低，在600 W时得到最大值。当微波功率在400～600 W时，可能是因为反应混合体系在微波作用下产生大量气泡，有利于溶剂的浸入，促进对物料细胞的穿透作用[23]，达到精油提取率的提高。当微波功率高于600 W，微波产生的热效应过强，可能导致部分精油挥发损失[24]，造成提取率下降。

2.2 响应面实验设计及结果

2.2.1 响应面实验设计

依据单因素实验的数据分析结果，确定微波功率(A)、微波时间(B)、液料比(C)3个主要影响因素进行实验。设计方案及实验结果见表2。

表2 响应面实验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiment

续 表

2.2.2 回归方程的建立及方差分析

用Design Expert软件对表2中的数据进行多元回归拟合，得到以精油提取率Y为响应值，以A微波功率、B微波时间、C液料比为自变量的回归方程为：Y=0.41-0.014A+0.023B- 0.014C+0.015AB+0.038AC+0.05BC-0.026A2-0.044B2-0.051C2，回归模型方差分析结果以及回归方程系数显著性检验结果见表3。

表3 回归模型的方差分析Table 3 ANOVA of the regression model

注：P<0.05表示影响显著；P<0.01表示影响极显著。

对表3中数据进行分析，可得出以下结果：整个回归模型是极显著的(P<0.01)，失拟项检验不显著，表明该模型拟合性较好，相关系数R2=0.9761，具有显著意义，该模型可用于对AKEO的提取进行分析和预测。在此模型影响因素中，具有8个显著项，A，C显著，B极显著，说明响应面优化实验选取的3个单因素对AKEO得率具有显著影响；其交互因素AC、BC即微波功率和液料比、微波时间和液料比之间的交互作用对精油得率具有极显著影响；二次项A2、B2、C2对精油得率具有极显著影响。

2.2.3 响应面曲面图分析

通过Design Expert软件处理回归方程，根据回归分析结果做出相应的响应曲面图，见图2。

a.微波功率和微波时间

b.微波功率和液料比

c.微波时间和液料比

由图2中a可知，等高线向微波时间轴变化更为密集，且微波时间3D曲面变化更为陡峭，说明微波时间对精油提取率的影响更为显著，且随着微波时间的增加，精油提取率先提高后降低，在微波时间为7 min左右，微波功率为550 W左右时，达到最大值。由图2中b可知，等高线向微波功率和液料比两轴变化一致，且曲面变化较为一致，在二者协同作用下，当微波功率达到550 W附近，液料比8∶1左右时，精油提取率最高。由图2中c可知，等高线向微波时间轴方向变化更为密集，且微波时间3D曲面变化更为陡峭，说明微波时间对精油提取率有显著影响，在二者的协同作用下，在液料比为5∶1～10∶1，微波时间在6～7 min之间，微波时间越长，液料比越高，会使溶剂对细胞的损坏程度加剧，有利于精油提取率的增大。

2.2.4 最佳提取条件的确定

通过模型预测得到的最佳AKEO提取条件为：微波功率550.6 W，微波时间6.99 min，液料比8.40∶1 (mL/g)，预测AKEO的提取率为0.42%。考虑实验的可操作性，修正为微波功率550 W，微波时间7 min，液料比8∶1 (mL/g)。为验证回归模型预测的结果，选取修正后的条件进行3次重复实验，精油提取率平均为0.4%，与预测值相近，相对误差为4.8%。由此看见，该优化条件可用于AKEO的提取。

2.3 包结常数的测定

2.3.1 AKEO与K-β-CD-MOF体系的紫外吸收光谱

在相同光谱条件下，测定了AKEO与不同浓度K-β-CD-MOF溶液形成的包结物的紫外分光光谱，结果见图3。

图3 不同浓度的K-β-CD-MOF溶液对精油吸光度值的影响Fig.3 Effect of K-β-CD-MOF solution with different concentration on the absorbance of essential oil

注：K-β-CD-MOF浓度(图中1→6)分别为0×10-3，0.2×10-3，0.5×10-3，1×10-3，2×10-3，3×10-3mol/L。

由图3可知，在波长278 nm处，随着K-β-CD-MOF溶液浓度的增加，精油的最大吸收波长略有红移，这种现象说明精油进入K-β-CD-MOF空腔后，与其产生多种作用力，如氢键、范德华力等，对其电子云产生干扰，造成最大吸收波长红移以及吸光度上升。最高吸收峰的吸光度增加也表明精油与K-β-CD-MOF形成了包结物[20]。

2.3.2 AKEO与K-β-CD-MOF包结

根据Hildebrand-Benesi方程进行数据拟合(n取值1～5)，拟合结果表明当n=1时，AKEO与K-β-CD-MOF体系的双倒数图线性关系良好，结果见图4。说明AKEO与K-β-CD-MOF包结过程中形成了1∶1型包结物。包结物的形成为动态平衡过程，包结常数受反应温度影响。根据范特霍夫方程作图并计算得到包结反应的热力学参数，不同反应温度下的包结常数和热力学参数见表4。

图4 不同温度下精油与K-β-CD-MOF体系的双倒数图Fig.4 Double reciprocal plot of essential oil and K-β-CD-MOF systems at different temperatures

表4 AKEO与K-β-CD-MOF包结过程的包结常数和热力学参数Table 4 Inclusion constants and thermodynamic parameters of AKEO and K-β-CD-MOF during inclusion process

由表4可知，ΔH>0，随着温度的逐渐升高，包结物的K值逐渐增大，说明该反应为吸热反应，在包合物制备时可选择在较高温度进行，升温有利于该包结物的形成；ΔG<0，表明该包结物自发形成，为自发反应，随着温度的升高，负值逐渐变大，包结反应自发倾向增大；ΔS>0，可能是因为精油分子被包含在K-β-CD-MOF空腔内，使得溶液系统中精油分子减少，使得熵减少，同时客体分子进入空腔后，一些水分子被释放出来，导致熵的增加。由于熵增加效应远远大于熵减少效应，因此结果为熵增加[28]。同时也表明该包结过程中疏水作用起着重要的作用[29]。ΔH>0且ΔS>0，根据吉布斯-赫姆霍兹公式说明该反应为熵效应驱动过程[30]。

3 结论

本研究首先利用单因素实验确定了提取AKEO的条件优化范围，进一步通过响应面实验优化得到最佳提取条件。制备了以K-β-CD-MOF为壁材的K-β-CD-MOF-AKEO，研究其与AKEO的包结作用，结果表明K-β-CD-MOF与AKEO的包结比为1∶1，包结后AKEO最大吸收波长红移，吸光度规律性增大，可证明包结物的形成。热力学参数则表明该反应为吸热的保留自发反应，温度的升高有利于包结反应的发生。