白杨素对急性痛风性关节炎NLRP3炎性体的作用机制探讨

张涵 丁雨琦 陈伟圣 金丽霞* 金怡

急性痛风性关节炎（AGA）是一种因嘌呤代谢紊乱而引起尿酸盐（MSU）沉积的关节炎症，沉积的尿酸盐结晶被核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）识别后激活炎症信号通路，刺激机体产生炎症反应［1］。目前，分子对接技术应用于研究中药作用机制的报道屡见不鲜，通过结合结构生物学、计算机科学和网络药理学等学科的研究方法，建立物质-靶点-药效关系，发掘药物活性成分及疾病治疗位点，预测药物的多靶标作用及其脱靶效应［2］。2017年10月至12月作者通过动物实验，研究黄酮类单体药物白杨素对痛风性关节炎的作用机制，为治疗痛风性关节炎提供药物研究方向和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物ICR雄性小鼠SPF级40只，体重20g左右，上海BK公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2013-0016。

1.2 试剂与材料秋水仙碱（国家标准品物质）；白杨素、尿酸钠（上海源叶生物科技有限公司）；TNF-α试剂盒、RIPA裂解液、PMSF；兔抗Caspase-1多克隆抗体、兔抗NLRP3多克隆抗体（英国abcam公司）；BCA试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 仪器及软件XA205DU电子天平（瑞典METTLERTOLEDO公司）；Multiskan酶标仪（美国Thermofisher公司）；高速冷冻离心机、-80℃冰箱（ThermoFisher）、SDS-PAGEN凝胶垂直电泳槽（美国BIORAD公司）；化学发光凝胶成像仪（美国Aplegen公 司）；AccelrysDiscoveryStudio2.5、ChemBioOffice2010、PyMOL2.0.6、AutoDockTools1.5.6。

1.4 方法（1）分子对接数据建立：文献查找白杨素（Chrysin）结构式，于软件ChemBio3D中设置参数进行分子力场MM2、动力学模拟优化，并进行类药性质分析，建立分子对接配体。查询与NLRP3炎性体、痛风相关的报道，最终确定以NLRP3、caspase-1、ASC、pro-caspase-1、IL-1β、pro-IL-1β，6个NLRP3炎症通路传递蛋白为靶点，从RCSB数据库中筛选对应的人源受体靶蛋白［3］，建立分子对接蛋白库，见表1。（2）蛋白预处理：采用软件DiscoveryStudio2.5预处理靶蛋白（PrepareProtein），包括清洁蛋白质、去除水分子等操作，处理完毕后导出为PDB格式存储，可得半柔性蛋白。（3）分子对接流程：使用软件AutoDock进行分子对接，导入预处理后的白杨素及经DiscoveryStudio2.5处理的靶点蛋白。参数文件准备：使用AutoGrid4.0进行能量格点计算，以靶点蛋白为中心坐标，设置GirdBox网格区域。使用AutoDock4.0搜索网格范围内对接区域，采用拉马克遗传算法（LamarckianGA4.2），每个小分子配体均设定得到20个构象，初始种群数设置为150，能量评定最大次数为2500000，其他参数选择默认值。分子对接计算：运行AutoGrid4.0进行格点中相关能量的计算，运行AutoDock4.0进行半柔性对接，对结果进行聚类分析，并将对接较好的蛋白构象导出至PyMOL，分析观察白杨素与NLRP3炎症信号蛋白的结合情况。（4）动物分组及处理：40只ICR雄性小鼠，随机分为正常组、模型组、阳性组和白杨素组，适应性培养1周后，于每天早上10点，以0.1ml/10g为注射量，腹腔注射为给药方式，正常组和模型组注射生理盐水，白杨素组和阳性组分别注射白杨素和秋水仙碱溶液，1次/d，连续6d总计6次。第4次给药即第11d时，给药前测量小鼠右后足掌厚度，给药1h后即第11天11点时造模：模型组、阳性组和白杨素组小鼠足掌底部注射0.05ml（250mg/ml）的尿酸钠造模建立AGA模型，正常组注射等量生理盐水，得急性痛风性关节炎小鼠模型。（5）药物对小鼠足掌关节炎症的影响：造模后4、8、12、24、48h分别进行小鼠足掌肿胀程度评估（肿胀度=测量时小鼠右后足掌厚度÷测量时小鼠左后足掌厚度）。（6）药物对小鼠TNF-α、Caspase-1、NLRP3、脏器指数的影响：末次足掌肿胀程度评估后，处死小鼠，摘眼球取血分离血清，采用酶联免疫吸附法测定血清中TNF-α含量，测定步骤按照试剂盒说明书；摘取肾脏组织称重计算脏器指数，以Westernblot检测肾脏组织Caspase-1、NLRP3蛋白含量。脏器指数（%）=（动物肾脏重量g）/（动物体质量g）×100%。

表1 人源受体蛋白信息表

1.5 统计学方法采用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较采用重复测量数据的方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白杨素与通路蛋白作用靶点分析以结合能和抑制常数为判断依据［4］，对接结果中NLRP3（PYD区）、caspase-1的抑制常数分别为9.13、5.20，提示其与白杨素结合较好。PyMOL分析靶点结合情况，白杨素C5上的羟基与NLRP3第23位赖氨酸的羰基形成氢键；白杨素C7上的羟基即可与caspase-1肽链上第149位丝氨酸的羰基形成氢键，还可与第152位的异亮氨酸上的氨基形成氢键；由于白杨素与靶点蛋白之间的这些作用力，才使化合物可以与靶标紧密结合，从而抑制其作用，产生药效，提示白杨素作用靶点为NLRP3炎症通路中的NLRP3和caspase-1蛋白，作用机制为阻断NLRP3N端PYD区域募集ASC以及改变caspase-1蛋白的正常生理活性，中断信号传递，防治痛风性关节炎。见表2。

表2 白杨素-受体蛋白对接结果及白杨素-受体蛋白氢键相关信息表

2.2 白杨素对小鼠足掌关节炎症的影响与正常组比较，模型组足掌肿胀程度明显升高（P<0.01），表明造模成功。与模型组比较，12h后白杨素组和阳性组肿胀程度降低（P<0.05），24h后白杨素组和阳性组肿胀程度明显降低（P<0.01）。见表3。

表3 小鼠足掌肿胀程度（±s）

表3 小鼠足掌肿胀程度（±s）

注：与模型组相比#P<0.05；##P<0.01

组别 4h 8h 12h 24h 48h正常组 1.08±0.056 1.06±0.107 1.04±0.045 1.05±0.041 1.04±0.040模型组 1.93±0.134 2.12±0.165 1.85±0.181 2.04±0.204 2.05±0.215阳性组 1.60±0.275 1.77±0.126## 1.63±0.142# 1.48±0.087## 1.30±0.025##白杨素组 1.70±0.163 1.81±0.173 1.65±0.230# 1.66±0.069## 1.65±0.107##

2.3 白杨素对小鼠TNF-α、脏器指数的影响各组小鼠脏器指数发现，相对于模型组，正常组和白杨素组差异均有统计学意义（P<0.05）。见图1。

图1 白杨素对小鼠脏器指数、TNF-α表达的影响

2.4 白 杨 素 对 小 鼠 肾 脏NLRP3、caspase-1的影响与正常组比较，模型组小鼠肾脏NLRP3、Caspase-1蛋白量升高（P<0.01），提示造模成功；与模型组比较，给药组小鼠肾脏NLRP3、Caspase-1蛋白量降低（P<0.01）。见表4。

表4 白杨素对小鼠肾脏NLRP3、Caspase-1表达的影响（±s）

表4 白杨素对小鼠肾脏NLRP3、Caspase-1表达的影响（±s）

注：与正常组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01

组别 NLRP3 Caspase-1正常组 0.41±0.01 0.12±0.01模型组 0.93±0.01* 0.55±0.02*阳性组 0.48±0.02# 0.15±0.01#白杨素组 0.59±0.02# 0.2±0.03#

3 讨论

NLRP3作 为 一 种NOD样 受 体（NODlikereceptors，NLRs）由LRR-NACHT-PYD（NALP3）三部分组成，在巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞中大量表达，可作为模式识别受体（PRR）在炎症通路中起启动作用，沉积的MSU被NLRP3C端的富亮氨酸区（LRR）识别，N端的热蛋白结构域（PYD）则与相关凋亡点样蛋白（ASC）N端的PYD区相结合，而ASC的C端与半胱天冬酶（caspase）的CARD相结合，从而形成复杂的NLRP3炎性体，并在三磷酸腺苷（ATP）的作用下寡聚化，活化capase-1，酶解pro-IL-1β释放成熟的IL-1β介导炎症激活体内炎症因子的表达。

炎性体LRR区域不仅可在识别病原相关分子模式（PAMPs）后激活NLRP3炎性体，还与线粒体代谢有关：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH）作用下产生的大量ROS使硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）游离，并与NLRP3的LRR区结合，激活炎性体［5］，抑制LRR区正常活性可中断NLRP3炎性体活化，而在LRR活化后，热休克蛋白90（HSP90）、泛素连接酶相关蛋白SGT1（SGT1）脱离NLRP3［6］，使NACHT寡聚化结构域暴露，在ATP聚合作用下发生寡聚化，刺激PYD募集Caspase-1，通过酶解pro-IL-1β产生IL-1β炎症因子，同时体内被活化的免疫细胞可将胞内ATP转移至细胞间隙激活嘌呤能离子通道型受体7（P2X7R），促进IL-1β、IL-18、IL-6及肿瘤坏死因子（TNF）-α等的释放，激活多条胞内信号通路［7］，与药物治疗研究过程中发现痛风性关节炎模型小鼠不仅caspase-1蛋白浓度明显升高，TLRs/NF-κB通路、MAPK、氧化损伤等机制也被激活的相关报道一致［8-9］，不仅提示白杨素可能具有多靶性，也指出P2X7可作为痛风治疗研究靶点，现有文献报道黄酮类化合物因其独特的结构而具有抗炎抗氧化能力，发现如果A环上的C-5，7位均有羟基取代时，有利于抗氧化活性，并会对细胞的增殖、分泌以及细胞的相互作用产生影响，产生强烈的抗炎作用［10］，现有研究也证明白杨素具有抗氧化损伤的作用［11］，而NLRP3炎性体具有双重性，既可介导正常的生理反应，保护机体，也可放大炎症效应，因此在对NLRP3炎性体过程中要避免影响其正常生理活性［12］。

分子对接方法均通过构象搜索和能量评估两个阶段，对已知结构的配体和蛋白质的结合模式及结合自由能进行预测［13］。在构象搜索中，全局搜索算法和启发式搜索算法的应用最为广泛，前者采用刚性的对接模式，虽然可加快对复合物全局的位点搜索，但并不适合配体与蛋白质未知结合部位的研究；后者为AutoDock、Vina、GOLD、Glide等常用软件的算法，研究范围局限于结合位点附近，但是将柔性对接纳入考虑范围，准确性更高；此外，进行能量评估的打分函数也有不同的特点，因此合适的计算模式，可提高对接研究的可靠性。