发光细菌法测定SO2气体生物毒性的研究

韩丽君 孙玉娟 杨树平 邢志贤 赵峥 柳蕊

(河北省生态环境监测中心，河北 石家庄 050037)

生物毒性检测是利用生物监测环境和化学品毒性的技术。发光细菌法环境毒性检测技术因其灵敏度高、反应速度快、相关性好等原因被广泛应用在环境监测中，目前主要应用于饮用水[1-3]、污水[4]、土壤和沉积物[5,6]等毒性检测。尽管生物毒性检测实验方法相对简单，但仍存在很多局限性，如充废气的快慢、与菌液接触时间长短、充废气的量等因素都会对实验结果造成影响，所以发光细菌比较少的运用在大气污染毒性检测中[5]。

本次研究以SO2为标准毒性气体，通过向青海弧菌悬浮液中通入不同浓度的SO2标气，然后分别测定菌液发光强度，以发光抑制率表征气体的生物综合毒性。通过优化实验条件，建立了系统的气体生物综合毒性测试方法。实验结果表明，可以通过优化曝气设备的精密性来提高监测的灵敏度和精密度，具有较好的应用前景。

1 材料与方法

1.1 供试材料

青海弧菌Q67冻干粉剂(配有复苏稀释液和渗透压调节液)；

发光菌冻干粉复苏液；

渗透压调节液；

超纯水；

500ppm(20℃、108.8kPa 条件下折算浓度为1429mg/m3)SO2标准气体，纯净空气做填充气；

缓冲溶液。

1.2 实验仪器

毒性分析仪： ToxScreen-III；

采样泵(BDQ-3000，量程0.1～3L/min)、曝气泵(TWA-300T，量程0.02～0.5L/min)；

移液枪：100μL、1mL、2mL；

烧杯：100mL；

测试管：5mL。

1.3 实验方法和步骤

1.3.1 SO2标气制备

用Entech4600型动态稀释仪和纯净空气将SO2标准气体稀释成浓度分别为28.6(10)、57.1(20)、85.7(30)、114.3(40)、142.9 (50)mg/m3(ppm)的SO2系列标气。

1.3.2 发光菌液复苏

取1支青海弧菌Q67冻干粉置于室温(20±1°C左右)平衡15min；

取0.5mL复苏稀释液加入到平衡后的青海弧菌Q67冻干粉试剂瓶中；

溶解后的冻干粉溶液置于室温下复苏10min后备用。

1.3.3 曝气

取2组干净的5mL测试管，分别加入2mL渗透压调节液和50μL复苏菌液，震荡混匀。立即向其中1组测试管中通入系列浓度的SO2标气，测定其最终发光值I；同时向另一组测试管中加入0.05mL冻干粉溶液，震荡混匀，通入等时间、等流量的纯净空气，测定最终发光值I0，作为空白对照组。

1.3.4 曝气时间选择

按照1.3.3方法以114.3mg/m3的SO2为受试气体依次测定不同曝气时间梯度的发光菌液发光值，从而选择合适的曝气时间。

1.3.5 标准曲线绘制

按照1.3.3方法依次测定曝入系列SO2标气(1.3.1)的发光菌液发光值，并计算标准曲线的线性回归方程。

1.3.6 计算发光抑制率公式

E =(I - I/I0)×100%

式中，E为发光抑制率；I为发光强度；I0为空白发光强度对照值。

2 结果与分析

本次实验的影响因素主要包括实验温度、菌液活性、曝气流量、曝气时间等。实验室温度和菌液活性影响因素已有比较充分的研究[7-9]，实验过程中要保持室温20±1℃，且所有测试器皿、试剂及溶液测试前1h均置于控温的测试室内。本次研究不再做进一步验证。

2.1 曝气流量选择

向待测菌液中通入SO2标气时，要考虑气体的流量，防止流速过快从而溢出测试管，还要保证气体与菌液能充分接触，有足够的氧气供应。实验表明，曝气流量越大，发光抑制率越大。由于发光菌液曝气时会产生泡沫，流量过大会导致菌液溢出而影响实验结果。因此，本次实验的曝气流量选择菌液不会溢出最大流量0.02L/min。

2.2 曝气时间优化

向1组配置好的待测菌液中依次通入浓度为114.3mg/L的SO2标气，曝气时间分别设置为2、3、4、5、6min，分别测定发光强度并计算相应的发光抑制率E。实验结果表明，曝气时间和发光抑制率呈指数上升关系，相关系数R2=0.91，即曝气时间越长灵敏度越高，详见图1。但是，曝气时间越长空白菌液发光值也越高，增大了实验误差，综合考虑以上2方面因素，以下实验均将曝气时间定为5min。

图1 青海弧菌Q67发光抑制率与SO2曝气时间关系

2.3 发光抑制率与SO2浓度的效应关系

根据以上优化的实验条件，在室温20℃下，向1组配置好的待测菌液中依次通入不同浓度的SO2标气，SO2标气浓度分别设置为28.6、57.1、85.7、114.3、142.9mg/m3，曝气流量设置为0.02L/min，曝气时间设置为5min，测定发光强度并计算发光抑制率E。实验结果表明，青海弧菌Q67的发光抑制率与SO2标气浓度呈指数相关，Lg(100E)与SO2标气浓度线性相关(R2=0.96)，详见图2、图3。

图2 青海弧菌Q67的发光抑制率(E)

图3 青海弧菌Q67的Lg(100E)与SO2标气浓度关系

2.4 实验精密度

本次研究选择抑制率分别接近90%、50%、10%(实测结果分别为99.6%、54.3%、11.1%)的样品代表高、中、低抑制率分别进行精密度测试。每个浓度平行测定3次，相对标准偏差分别为5.2%、20.6%、10.3%。高抑制率和低抑制率3次重复测定结果的相对偏差均小于发光细菌在水质中急性毒性测定的最低精密度要求15%[10]，中抑制率样品测定精密度较低(20.6%)。

与发光菌法测定水质生物综合毒性相比，气体毒性实验增加了曝气过程，所以误差较大。气流量的稳定性和准确性是影响整个实验准确度的重要因素。实验装置的气密性可通过装置的改进优化方式解决。

2.5 方法检出限

由图2曲线可以计算出发光抑制率为90%、50%、10%所对应的SO2的浓度分别为143mg/m3(全有效浓度界限值)、112mg/m3(半数效浓度)、25.4mg/m3(无效浓度界限值)。当抑制率为10%时，测试的SO2浓度为25.4mg/m3，可做为本实验的方法检出限。该检出限低于国家大气污染物排放标准(GB13271-2014)中SO2最严限值(50mg/m3)。同时，发光菌法毒性测试的LC50(112mg/m3)值也远低于小鼠毒性值(6600mg/m3)。因此，该方法具有很好的灵敏度和实用价值。

3 结论

实验结果表明，SO2对青海弧菌的发光性有明显抑制作用，且发光抑制率和SO2浓度有显著的相关性，可以据此相关性定量测定空气中SO2的生物毒性；相较于传统的生物监测用动物(如老鼠)作为受试对象，用发光细菌来测定气态生物综合毒性的方法简单、快速且检出限低，能够更好地应用到实际的环境监测当中；与水质生物综合毒性测试方法相比增加了待测气体的曝气过程导致精密度较差，需进一步提高曝气设备的精密度和自动化水平。