大孔树脂纯化薜荔茎总黄酮的工艺研究

王晓华 韦汉燕 桂劲松 韦巧慧

【摘 要】 目的：研究AB-8大孔树脂纯化薜荔茎总黄酮的工艺条件。 方法：采用紫外分光光度法测定薜荔茎中总黄酮的含量。以静态吸附和动态解吸为考察指标，确定了薜荔茎中总黄酮纯化的最佳工艺参数。 结果： AB-8型大孔吸附树脂纯化薜荔茎总黄酮的优化工艺条件为：上样浓度为0.5g生药材/mL，样品溶液pH为7，上样量为14BV，上样速度为1mL/min，静态吸附4h。先用5BV的蒸馏水冲洗，然后用8BV 70%乙醇以1mL/min的速度洗脱大孔树脂。经AB-8树脂处理后的薜荔茎总黄酮质量分数达64.32%。 结论：优化的纯化工艺稳定可行，可以用于纯化薜荔茎中的总黄酮。

【关键词】 薜荔;总黄酮;大孔树脂;纯化

【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2020）24-0034-05

Abstract：Objective To investigate the technology of purification of total flavonoids from the stem of Ficus pumila L.by AB-8 macroporous resin. Methods The content of total flavonoids in the stem of Ficus pumila L. was measured by UV ， dynamic adsorption and static adsorption were took as index to optimize the technology of purification of total flavonoids. Results The optimal purification conditions were as follows： The concentration of sample was 0.5g/mL ， sample pH value was 7， sample volume was 14 column volume， the flow rate was 1mL/min， statically adsorb 4h， rinse with 5 column volume distilled water for impurities， the macroporous resin was eluted with 8 column volume of 70% ethanol at a rate of 1mL/min. The purity of total flavonoids increased to 64.32%. Conclusions Optimal purification technology is stable and reliable， which is suitable for purification of the total flavonoids from the stem of Ficus pumila L.

Keywords：Ficus pumila L.; Total Flavonoids;Macroporous Resin; Purification

薜荔（Ficus pumila L.）来源于桑科榕属[1]，主要分布在广西、湖南、四川等省区，其有相当膨大的成熟花托，像无花果，俗称“鬼球、鬼馒头”，最早于明朝的《本草纲目》中记载。薜荔在我国药用历史悠久，根、茎、叶和果实为药用部位，具有祛风除湿、固肾填精、活血通络、消炎解毒、抗菌、增强免疫力、抗肿瘤、抗感染、消炎镇痛、驱虫等作用[2]。近年研究结果显示，薜荔植株的各部位均含有黄酮类物质，尤以茎部含量丰富。黄酮类化合物是一类有抗氧化作用的化合物，其生理活性强，能抗动脉硬化，降低胆固醇，抗痉挛、抗辐射[3]。薜荔植株中的黄酮含量颇高，具有很高的开发利用价值，但目前缺乏对薜荔茎中黄酮类成分的研究。本实验选择AB-8大孔吸附树脂，通过静态吸附和动态解吸试验，筛选出薜荔茎总黄酮纯化的最佳工艺条件，为薜荔茎总黄酮的开发利用提供参考。

1 仪器与材料

1.1 材料 薜荔茎药材，购自广西桂林中草药批发市场，经桂林医学院王晓华副教授鉴定为桑科榕属薜荔Ficus pumila Linn的干燥茎;芦丁对照品（中国药品生物制品鉴定所）;亚硝酸钠（AR 汕头市西陇化工股份有限公司，批号：130902）;九水合硝酸铝（AR 汕头市西陇化工股份有限公司，批号：140304）;氢氧化钠（AR 武汉宏大化学试剂厂）;AB-8型大孔树脂（天津市海光化工有限公司）。

1.2 主要仪器 CP225D电子分析天平;SHZ-B水浴恒温振荡器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）;UV-1600PC型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）;SHB-IIIT循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）;RE-5203旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

2 方法与结果

2.1 薜荔茎总黄酮的测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品10.05mg干燥至恒重，置于50mL容量瓶中，用70%乙醇溶液溶解，稀释至刻度，摇匀，即浓度为0.201mg/mL溶液。

2.1.2 最大吸收波长的确定 准确吸取芦丁对照品溶液1.0mL，置于25mL容量瓶中，加入5%的亞硝酸钠溶液1.0mL将其振荡后静置6min，加入1.0mL的10%硝酸铝溶液，将其振荡放置6min后加入4.0mL的4%氢氧化钠溶液，最后用70%乙醇溶液调至刻度线[4]，振匀放置15min显色。以不含对照品溶液的相应试剂作为空白对照，测定200～800nm 扫描波长范围内的吸光度，得到最大吸收波长为503nm。因此，以503nm作为测量波长。

2.1.3 线性关系的确定 准确吸取芦丁对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，置于25mL容量瓶中，照“2.1.2”项下方法，以对照品溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，测定503nm处的吸光度，得到标准曲线：A=10.382 C+0.0034（r=0.9993），结果如图1所示。芦丁浓度为0～0.0482mg/mL时线性关系较好。

2.1.4 薜荔茎提取液的制备 将薜荔茎药材粉碎，过80目筛。取100g薜荔茎粉末，置2000mL圆底烧瓶中，加入十倍量70%乙醇浸渍30min，装上冷凝回流装置，加热回流提取共3次，每次1h，趁热抽滤[5]，最后用旋转蒸发仪减压浓缩至浓度为1g生药材/mL薜荔茎提取液，作为样品溶液。

2.1.5 薜荔茎总黄酮的含量测定 精密吸取1.0mL薜荔茎提取液，用70%乙醇稀释至10mL，摇匀，再从中吸取0.5mL放置于25mL容量瓶中。然后按“2.1.2”项下方法加入显色试剂，以70%乙醇和相应的显色剂为空白，测定503nm处的吸光度值，并根据回归方程计算总黄酮含量[6]。得薜荔茎总黄酮含量为6.25mg/mL。

2.2 大孔树脂的预处理 取适量的AB-8大孔树脂置于烧杯中，用适量95%酒精浸渍AB-8大孔树脂24h， 使其充分膨胀后采取湿法进行装柱，用95%酒精动态冲洗树脂，再用蒸馏水将树脂冲洗直到嗅不到酒精味;将5%盐酸加到柱子里浸泡树脂2h后用蒸馏水动态冲洗树脂使洗脱液的pH值呈中性， 然后将5% NaOH溶液加到柱子中浸泡树脂2h后用蒸馏水动态冲洗树脂至洗脱液呈中性;用95% 乙醇冲洗树脂使洗脱液与水混合（1∶5）至无白浊现象产生， 最后用蒸馏水冲洗树脂至洗脱液无酒精味， 留着备用[7]。

2.3 AB-8树脂吸附因素的考察

2.3.1 AB-8大孔吸附树脂静态吸附和静态解吸实验

2.3.1.1 静态吸附 准确称取经过处理的2.0g（湿质量） AB-8大孔树脂放入50mL具塞三角烧瓶中，加入30mL薜荔茎提取液（1g生药材/mL）。将塞子盖紧并于37℃水浴中振荡12h。取上清液测定吸光度。根据标准曲线方程计算总黄酮的浓度，得出静态吸附率和吸附容量。 吸附量Q=（C0-Cr）V/W。在公式中，Q是吸附量（mg·g-1树脂）， C0是初始质量浓度 （mg/mL），Cr是吸附后的黄酮含量 （mg/mL），V是溶液的体积 （mL）， W是树脂的质量（g）。吸附率=（吸附前黄酮含量/吸附后黄酮含量）/吸附前黄酮含量×100%。

由表1可知，树脂静态吸附量为50.03mg/g，吸附率为53.36%。

2.3.1.2 静态解吸 将已静态吸附的饱和大孔树脂用蒸馏水冲洗到洗脱液呈无色。然后加入70%乙醇30mL并在37℃水浴振荡器上摇动12h解吸。解吸后，通过吸取上清液测定吸光度。根据标准曲线方程计算总黄酮的浓度，得出静态解吸率。解吸率D（%）=（V×Cr）/（W×D）×%。式中：Q为吸附量（mg·g-树脂）;Cr为解吸后溶液中黄酮的含量（mg/mL）;V是溶液的体积（mL）;W为树脂的质量（g）。由表2可知，静态解吸后的解吸率为84.61%。

2.3.1.3 静态吸附动力学研究 称量2.0g（湿质量）已处理过的树脂置于50mL的带塞三角瓶中，再加入30mL浓度为1g生药材/mL的薜荔茎提取液，在恒温器 37℃处晃动2h， 每1h吸收一次上清液， 并测定吸光度值。以标准曲线方程确定总黄酮浓度及吸附率， 将时间作为横向坐标， 吸附率为纵向坐标，绘制动力学曲线。从图2结果可以看出， AB-8大孔树脂对薜荔茎总黄酮的吸附是一种快速平衡型吸附，随着吸附时间的增加，吸附速率在3h内迅速下降，4h后吸附速率稳定，吸附平衡基本达到。因此，吸附时间被确定为4h。薜荔茎总黄酮的富集纯化使用AB-8大孔树脂适宜。

2.3.2 吸附条件的考察

2.3.2.1 样品液的质量浓度的影响 分别加入70%的乙醇溶液稀释已制得的薜荔茎1g生药材/mL浓度的提取液，得到质量浓度分别为0.25、0.50、0.75 g生药材/mL的样品液。称量4份已预处理过的 AB-8大孔树脂，每2.0g（湿质量）为一份于50mL的具塞三角瓶中，分别加入质量浓度为0.25、0.50、0.75g生药材/mL的样品液30mL，在恒温水浴振动筛上于37℃放置4h，然后取上清液测量吸光度，得出总黄酮的浓度与吸附率。由表3可以看出，当该样品液浓度为0.5g生药材/mL时，薜荔茎总黄酮的吸附率最佳，因此选择0.5g生药材/mL作为样品液的质量浓度。

2.3.2.2 pH值的影响 称取5份已预处理的AB-8大孔树脂，每2.0 g（湿质量）为1份，把它们分别放进一个50mL的锥形瓶里，将浓度为1g生药材/mL的提取液30mL加入瓶中， pH调节至3、4、5、6、7在37℃下振荡3h。测量吸光度，计算得出总黄酮的浓度与吸附率。从表4可以看出，当pH在3 ～ 6范围时，AB-8大孔树脂对薜荔茎总黄酮具有较好的吸附率，当吸附介质pH值为7时，吸附率明显提高， 因此，吸附剂的pH值调到7最优。

2.3.2.3 泄漏曲线的绘制与上样量的确定 准确称取5.0g经过预处理的AB-8大孔树脂，湿法装柱，取0.5g生药材/mL浓度（pH调为7）的薜荔莖提取液，样品流速为1mL/min， 每10mL收集1个样品， 收集18份样品，测定吸光度值并计算总黄酮的浓度， 将药物溶液体积作为横坐标，将未吸附率绘制在纵坐标上以确定样品上柱体积。未吸附率=流出液中成分含量/上柱前原液中流出物含量。图3结果显示，上样量达140mL时发生明显泄漏，树脂柱不能完全吸附药液中的黄酮成分，所以上样量为140mL时更合理，故确定140mL（14 BV）作为最大上样量。

2.3.3 洗脱条件的考察

2.3.3.1 洗脱剂体积分数的影响 取5份已预处理的AB-8大孔树脂，分别放到50mL的具塞三角瓶中，并加入0.5g生药材/mL（pH=7）薜荔茎提取液适量使其吸附达到饱和，再加入不同体积分数的洗脱剂30mL（50%、60%、70%、80%、90%乙醇），放置于37℃的恒溫水浴中于振荡器摇动4h，取其上清液，以吸光度值来计算解吸速率。从表5可以看出，当乙醇的体积分数小于70%时，解吸首先下降然后上升，然后缓慢上升。因此，选取的洗脱剂为70%乙醇。

2.3.3.2 确定洗脱剂的用量 准确称量5.0g的AB-8大孔树脂，湿法装柱。取140mL浓度为0.5 g生药材/mL（pH调至7）的薜荔茎提取液，流速为1mL/min上样。用5倍柱体积（5BV）的纯水冲洗树脂除去杂质，用70%乙醇以1.0mL/min的流速洗脱至洗脱液呈无色，收集10mL/份的洗脱液来测定吸光度。用于计算总黄酮含量。以总洗脱量为纵坐标 （mg） ，洗脱量 （mL）为横坐标，得到动态洗脱曲线。 总洗脱量（mg）=Cd2×Vd2。式中，流出物的总黄酮质量浓度为Cd2，洗脱剂体积为Vd2。从图4可以看出，当洗脱液为80mL（约8BV）时，茎中的总黄酮已被完全洗脱，因此选择8BV作为洗脱剂的量。

2.4 工艺验证试验 对上述所得到的最优工艺条件进行3次重复试验验证，计算大孔树脂富集纯化后薜荔中总黄酮的质量分数。经过3次验证试验，从表6可知大孔树脂富集纯化后的薜荔茎总黄酮的质量分数分别为65.04%、63.56%、64.37%，平均质量分数是64.32%，其结果表明，AB-8大孔树脂对薜荔茎总黄酮的富集纯化过程是稳定可行的。

根据上述实验的结果，确定了薜荔茎总黄酮的纯化工艺条件是：取薜荔茎提取液（0.5g生药材/mL），药液 pH=7，上样量14 BV，以1mL/mL的速度通过 AB-8大孔吸附树脂柱，静置4h，再用5 BV的蒸馏水来冲洗水溶性杂质，用8BV 70%乙醇以1mL/min的速度洗脱大孔树脂，将洗脱液减压浓缩。回收溶剂，烘干并干燥，得样品。

3 讨论

AB-8型大孔吸附树脂是一种具有极大比表面积、合适孔径的球形弱极性聚合物吸附树脂，它可通过表面吸附、氢键等作用于黄酮类化合物，是黄酮类化合物的优良吸附剂。本实验从静态吸附和动态解吸两个方面对AB-8大孔吸附树脂分离纯化薜荔茎总黄酮的工艺条件进行了研究。结果表明： 样品液的浓度、pH值、样品体积、静态吸附时间、乙醇体积分数、洗脱剂用量对薜荔茎总黄酮的吸附量和洗脱率影响较大。当乙醇的浓度小于70%时，解吸率呈先下降后上升再缓慢增长趋势。从实验结果可以看出，可选择70% ～ 90% 的乙醇体积分数来洗脱。由于考虑到实验室的经济效益方面，本实验以70%乙醇作为洗脱液浓度。实验结果显示，50.03mg/g为AB-8型大孔吸附树脂对薜荔茎总黄酮静态的吸附量，而84.61%是解吸附率，呈现出其具备较好的分离纯化能力。最优的吸附工艺条件是：取薜荔茎提取液（0.5 g生药材/mL），药液 pH=7，上样量14BV，以1mL/mL的速度通过 AB-8大孔吸附树脂柱，静置4h，再用5BV蒸馏水来冲洗水溶性杂质，用8BV 70%乙醇以1mL/min的速度洗脱大孔树脂，其洗脱液用旋转蒸发仪进行减压浓缩回收乙醇，干燥后得到红褐色膏状物。该工艺简单易操作，无污染，树脂可再生，生产效率高，具有一定的推广应用价值。

参考文献

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（收稿日期：2020-07-05 编辑：程鹏飞）