沙米生长特性调查及遗传多样性分析

聂峰杰,甘晓燕,张 丽,巩 檑,刘 璇,杨文静,宋玉霞

(宁夏农林科学院农业生物技术研究中心，宁夏 银川 750002)

沙米(Agriophyllumsquarrosum)别名沙蓬，藜科(Chenopodiaceae)沙蓬属(Agriophullum)，一年生草本流动沙丘先锋植物和优势物种，主要生长于流动沙丘、半固定沙地户外丘间低地，广泛分布于我国西北、华北各省的沙漠地带[1-3]。沙米种子富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、粗纤维和灰分，是适宜人类食用的营养食品[4]；同时沙米种子含有所有人体必需氨基酸，其蛋白质氨基酸模式与人体蛋白质氨基酸模式接近，是优良的功能食品，具有助消化、健脾胃、清热解毒、抗菌消炎等功效，是天然减肥食品和心脑血管、肾脏功能减退、糖尿病病人的理想食品[5-7]；沙米籽油主要成分为亚油酸、油酸和次亚油酸3种不饱和脂肪酸，有助于降低人体血清胆固醇和抑制动脉血栓[7-8]；沙米中还富含硒、锌、铁等元素[5，9]，生理活性物质皂甙、异黄酮、SOD及绿原酸生物碱含量较多[6]。沙米的食用历史悠久，据《沙洲都督府图经》记载，早在1300多年前敦煌人民便大量采集沙米做军粮[10]，至今，沙米做的炒面、凉粉、点心、羊肉面等仍是甘肃河西走廊和内蒙古等地备受欢迎的特色美食。沙米在长期进化过程中形成耐干旱、耐高温、耐贫瘠、耐风蚀、耐沙埋等特性，具有重要的生态价值、营养价值。开展沙米种植资源调查和遗传多样性研究，对优良种质资源筛选有重要意义。SSR(Simple sequence repeats)标记具有分布均匀、覆盖整个基因组、多态性高、共显性分离、位点转化型等优点，在燕麦(Avenasativa)[11]、苜蓿(Medicago)[12]、白羊草(Bothriochloaischaemun)[13]、马铃薯(SolanumtuberosumL.)[14]等牧草和作物种质资源的遗传多样性研究中广泛应用。

宁夏回族自治区和甘肃、内蒙古两省沙米野生种质资源丰富，本研究针对不同原生地开展了沙米的物候期调查，分析了不同地区沙米的形态、种子营养成分，利用SSR分子标记对宁夏回族自治区和内蒙古、甘肃两省的17个自然居群沙米进行遗传多样性分析，以期明确不同地区沙米的生长特性、种子品质和遗传多样性，为后期沙米优良种质资源筛选、育种和开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 调查采样地概况及种质资源材料

2018—2019年度在宁夏银川滨河新区(NY)、甘肃民勤县(GM)、甘肃武威市(GW)、内蒙古阿拉善左旗(NA)对沙米种质资源立地类型、物候期、器官形态学进行定点观测，对沙米种子中淀粉、脂肪、蛋白质、氨基酸等营养成分进行测定分析。

宁夏银川市滨河新区位于毛乌素沙漠西缘腹地，典型大陆性气候特征，光热充足，日温差较大，干旱少雨，蒸发强烈，风大沙多。多年平均降雨量180～220 mm，多集中在7—9月，占全年降水量的61.6%。年均蒸发量2 088.2 mm，为年降水量的10.5倍，年均相对湿度为56%。

甘肃民勤县西沙窝位于巴丹吉林沙漠和腾格里沙漠之间，典型大陆性荒漠气候，降水稀少，蒸发强烈，风大沙多，平均气温7.6℃，年均降水量115.41 mm，主要集中在7—9月，占年均总降水量的60%以上，年均蒸发量为2 664.0 mm，沙质荒漠草地流动、半固定沙丘。

甘肃省武威市东沙窝位于腾格里沙漠的南部,典型的温带半荒漠大陆性气候。年均气温9.9℃，年均降雨量139.9 mm，年平均蒸发量2 486 mm，属极干旱地区。

阿拉善左旗通古淖位于腾格里沙漠的东部，属温带荒漠干旱区，为典型的大陆性气候，干旱少雨，夏热冬寒，日照充足，蒸发强烈。年平均气温7.4℃，年降雨量40～50 mm，集中在6—9月，年蒸发量3 000～4 500 mm。

选择4个地区17个自然居群(表1)，随机收集8株以上的沙米叶片，提取DNA用于SSR多样性检测。

表1 17份沙米种质资源采样地点

1.2 研究方法

1.2.1 沙米物候期调查及形态观察 在每个调查试验地依据沙丘走向设置样线，平行设置3个1 m×1 m的样方，每个样方间隔10 m，共设置9个样方。根据沙米生长的实际情况，以沙米萌发、分枝期、开花、结果为不同物候期的界定指标，以20%～80%的沙米植株出现物候观测指标的时间区间确定为物候期。开花期采集沙米叶片、茎、花，利用体视镜20倍下观察沙米叶脉、花被片、雄蕊、花丝、花药等形态。

1.2.2 沙米种子营养成分分析 种子成熟后收集各样方中沙米种子，混合后各取3次重复检测营养成分。蛋白含量参照GB/T 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》[15]标准中凯氏定氮法测定，脂肪含量参照GB/T 5009.6-2016《食品中脂肪的测定》[16]标准中索氏抽提法测定，直链淀粉测定采用GB/T 15683-2008比色法;支链淀粉测定参照金玉红等[17]的双波长比色法; 氨基酸含量参照 GB/T 5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》[18]标准测定。种子营养成分检测为3次重复平均值。

1.2.3 基因组DNA提取 采用TIANGEN公司的离心柱式植物DNA提取试剂盒DP320-02提取。获得的DNA经1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000超微量分光光度计(Theromg公司，美国)，检测合格后，调节质量浓度至50 ng·μL-1备用。

1.2.4 SSR分析 选取23对多态性较高的SSR引物[19-20]对17份沙米资源进行扩增，筛选出13对(SF26、SF30、SF63、SF21、SF80、SM0027、SM0105、SM0097、SM0118、SM0137、SM0138、SM0148、SM0032)多态性高、重复性和稳定性好的引物用于本次试验。采用SSR-PCR反应体系为每20 μL反应体积中含有1×Mix，0.4 mM SSR引物，100 ng DNA模板。反应程序为模板预变性94℃反应5 min后，94℃模板DNA变性30 s，复性为50℃～60℃反应30 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后延伸为72℃反应10 min，4℃保存。扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

2 结果与分析

2.1 不同原生地沙米物候期调查

不同地区沙米的萌发、分枝、开花、结果、成熟的生长周期见表2。调查结果显示，4个地区的沙米生长周期为4月下旬到10月中旬，共150 d以上，宁夏银川市滨河新区沙米萌发时间较甘肃武威、甘肃民勤和内蒙古阿拉善晚10 d左右。

表2 不同原生地沙米物候期调查

2.2 不同原生地沙米形态比较

对不同地区沙米的叶片、茎、花等器官进行观察，结果发现，不同地区的沙米株高、种子千粒重、器官形态略有差别(见表3)。甘肃武威和甘肃民勤沙米株高和种子千粒重略高，株高可达128～130 cm，种子千粒重可达1.56～1.59 g；甘肃武威、甘肃民勤、内蒙古阿拉善的沙米叶长2～7 cm，宽0.1～0.7 cm，叶脉3～7条，花被片1～3，雄蕊2～3，花丝锥形，花药卵圆形；宁夏银川的沙米叶长1.5～5 cm，宽0.2～0.9 cm，叶脉5～9条。花被片1～3;雄蕊2～3，花丝锥形，花药长圆形。

注：A～D：内蒙古阿拉善沙米；A：叶片；B：茎；C：花药：D：子房。a～d：宁夏银川沙米；a：叶片； b：茎；c：花：d：子房。Note: A～D: Agriophyllum squarrosum from NA；A:leaf；B：stem；C：anther；D:ovary. a～d：Agriophyllum squarrosum from NY；a:leaf；b：stem；c：anther；d:ovary.

表3 不同原生地沙米种质生物学特性和器官形态特征

2.3 不同原生地沙米种子营养成分分析

对4个地区沙米种子的淀粉含量、蛋白质含量、硬脂酸、亚油酸、粗脂肪、氨基酸含量等营养品质指标进行了检测分析见图2，结果表明，4个地区沙米种子淀粉含量达278.00～307.46 mg·g-1，支链淀粉含量达164.50～185.45 mg·g-1，直链淀粉含量达94.03～103.61 mg·g-1，其中来自甘肃民勤沙米种子的淀粉、支链淀粉、直链淀粉含量显著高于其他3个地区；4个地区沙米种子蛋白质和氨基酸含量分别达到107.8～103.36 mg·g-1和30.32～49.85 μmol·g-1，甘肃民勤、甘肃武威、内蒙古阿拉善沙米种子的蛋白质含量显著高于宁夏银川地区，甘肃武威的沙米种子氨基酸含量达到49.85 μmol·g-1，显著高于其他3个地区；4个地区沙米种子中粗脂肪含量为46.80～54.90 mg·g-1，硬脂酸含量为9.23～15.47 mg·g-1，亚油酸含量为14.23～20.97 mg·g-1，其中甘肃民勤的沙米种子粗脂肪、硬脂酸、亚油酸含量分别达到54.90、15.47 mg·g-1和20.97 mg·g-1，显著高于其他3个地区。

注：不同小写字母表示同一种营养物质的含量在α=0.05水平差异显著。Note: Different lowercase letters represent significant difference of the amount of the same nutrient (ANOVA, α=0.05).

2.4 不同原生地沙米种质SSR多态性分析

按照最适反应体系及程序，利用23对SSR分子标记对3个省、自治区的17份沙米种质资源DNA进行了SSR遗传多样性分析，筛选出13对特异性较好的SSR引物(见图3)，分别为SM0027、SM0105、SM0097、SM0118、SM0137、SM0138、SM0148、SM0032、SM0042、SF80、SF26、SF21、SF30、SF63，共检测到76个条带，其中有39条多态性条带，多态性条带比率为51.3%。其中引物SF63的扩增条带为6条，引物SM0118扩增条带为4条。17份沙米材料的遗传变异较稳定，有一定的多态性，SSR标记能够解释沙米基因组部分信息量。

图3 引物SM0118和SF63对17份沙米样品扩增的电泳图谱

2.5 不同原生地沙米种质遗传变异及聚类分析

利用NTSYSpc (Version 2.10e)软件对14条引物扩增出的76个条带进行了分析，平均法聚类结果显示，每个SSR位点的PIC值为0.37～0.60，平均值为0.45。3个省、自治区沙米种质资源遗传相似性系数介于0.28～0.71之间。根据遗传相似性系数构建17个沙米种植资源遗传关系聚类图(见图4)，结果表明，17份种质资源居群水平的有一定的遗传多样性，与部分资源表观差异相一致。以0.58作为相似性系数分界点，17份沙米资源分为3类，采自宁夏滨河新区的6号资源、内蒙古阿拉善地区9号资源各分成为一类，甘肃民勤、甘肃武威、宁夏中卫等地区15份资源同为一类，其材料遗传相似度高，在地理位置上均属于腾格里沙漠腹地。

图4 17份沙米种质资源的UPGMA聚类图

3 讨 论

沙米生长在沙漠干旱环境中，可发挥防风固沙的生态作用。沙米种子萌发呈连续状，生长季节初降雨后部分沙米种子首先萌发，随着生长推进，大部分幼苗因缺水、高温、沙埋风蚀等不良环境因素影响而死去。雨季来临后，沙米种子大量可萌发生长为成熟个体。沙米种子具有光抑制和休眠机制[22]，为适应沙漠的恶劣环境，种子萌发受光照、温度、水分等诸多因素影响，不同年份、不同地区间植株生长的物候期受环境影响有较大差异，这种特性可以有效保护沙米种子，有利于种群的繁衍更新。

沙米种子营养丰富，具有人体所需的淀粉、蛋白质、脂肪等营养物质，我们所调查的4个原生地沙米种子的淀粉含量达到278.00～307.46 mg·g-1，蛋白质含量达到107.8～103.36 mg·g-1，粗脂肪含量为46.80～54.90 mg·g-1，其中被公认具有降低血脂、软化血管、降低血压、促进微循环作用的亚油酸含量达14.23～20.97 mg·g-1。沙米含有所有人类必需氨基酸，并且含量都高于藜麦、小麦和稻米[23]。由此可见，沙米不仅是营养价值极高的绿色有机食品，在医疗保健领域也具有巨大的开发潜力。沙米植株地上生物量较大，株高可达130 mm，开花前叶片柔软，叶量较丰富，鲜草含水量77%，粗蛋白4.4%、粗脂肪0.4%、粗纤维3.7%、无氮浸出物8.7%、粗灰分5.1%[24]，是荒漠及荒漠草原地区的重要饲用植物，具有饲草开发价值。

沙米生态适应性强，营养成分丰富，具有多方面的应用价值，极具人工驯化种植和产品开发的潜力。本研究调查分析4个不同原生境沙米的生长特性和种子品质，发现不同产地沙米的生长特性和种子营养成分含量有差异，甘肃民勤地区的沙米株高、种子千粒重、淀粉含量、蛋白质含量、粗脂肪含量均优于其余3个地区。利用SSR分子标记对来自3个省、自治区17份自然居群的沙米种质资源进行遗产多样性分析，检测到76个条带，其中有39条多态性条带，多态性条带比率为51.3%。同时，聚类分析结果表明，来自宁夏银川市滨河新区(NY)的资源与其他16份沙米资源遗传距离最远，与生物学特性调查及形态结构观察结果相一致，说明SSR分子标记可以区分17份种质资源的遗传多样性。研究结果可为扩展沙米种植资源的研究、利用，优良种植挖掘、培育新品种提供研究基础。