添加外源儿茶素制备高茶黄素红茶的工艺优化

王雨鑫，刘学声，刘建军，周富裕，马友力，邓燕莉*

(1.贵州大学 茶学院，贵州 贵阳 550025； 2.湖南省茶业集团股份有限公司，湖南 长沙431010；3.贵州省农业科学院 茶叶研究所，贵州 贵阳 550006)

茶黄素是由儿茶素类物质氧化缩合溶于乙酸乙酯呈橙黄色的一类茶色素物质，被誉为茶叶中的脑黄金[1-2]。茶黄素也是红茶中汤色亮的关键化学成分，主要影响红茶茶汤滋味强度和鲜爽度，是形成红茶金圈的主要构成物质[3]。茶黄素具有多种保健功能，在抗心血管疾病、抗肿瘤、抗氧化、清除自由基、杀菌消炎、提高免疫力等方面具有重要的医疗保健作用[4-5]。可见，提高红茶中茶黄素的含量对红茶品质的提升及增强红茶的保健功能均具有关键作用。目前，已有多项技术用于提高茶黄素含量，主要是通过改进萎凋和发酵工艺实现，在红茶加工中运用冷冻技术增强细胞膜透性、促进酶促反应能提高红茶产品茶黄素的含量[6-9]。温度是发酵过程中最重要的因素，能影响茶叶中多酚氧化酶等酶类物质的活性。滑金杰等[10-15]研究表明，发酵温度先高后低时所合成的茶黄素含量最高，且发酵温度22℃，发酵时间100～140 min，茶黄素的含量最高，发酵温度低于30℃有利于茶黄素的形成和累积。通过添加外源物质来促进红茶加工中茶黄素的合成也是一条重要的路径，在发酵过程中添加不同来源多酚氧化酶以及添加酶所需的金属离子均能促进茶黄素的整体合成[16-17]，添加不同比例儿茶素后，红茶中茶黄素的含量随着添加量的增加而增加[15]。在红茶加工过程中如在萎凋、提香过程中运用紫外光照射或黄光、远红外线照射，均能提高成品茶中茶黄素的含量[18-20]。因此，想要获得高茶黄素的红茶，改进萎凋工艺、发酵工艺、添加外源物质或酶是目前研究的重点。贵州省内当前主要种植的茶树品种是福鼎大白茶，贵州高海拔、低纬度、多云雾、无污染的高原生态使得夏秋季节茶树鲜叶儿茶素类物质含量较高且嫩度较好，但贵州茶产品以绿茶居多，红茶较少。为丰富贵州茶产品种类，以福鼎大白夏秋茶鲜叶为研究对象，在现有红茶加工技术的基础上，添加茶叶外源儿茶素提取物，优化儿茶素浓度、儿茶素添加比例、发酵温度和发酵时间的工艺参数，最大限度地酶促合成茶黄素，为高茶黄素红茶的开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 茶树品种 福鼎大白(Camelliasinensiscv Fuding-dabaicha)；采摘标准：一芽1叶和一芽2叶鲜叶；采摘地点：贵州省六盘水市六枝特区落别乡。

1.1.2 药品 纯度为50%和80%的儿茶素提取物，购于湖南三福生物科技有限公司；乙酸乙酯、正丁醇、95 %乙醇(AR)、碳酸氢钠(AR)、草酸(AR)等分析纯化学试剂，购于贵州博跃赛斯生物科技有限公司。

1.1.3 仪器 6CR-40型茶叶揉捻机，浙江上洋机械有限公司；6CFX-16型茶叶发酵机，浙江红五环制茶装备股份有限公司；6CHZ-9B型茶叶烘焙机，福建佳友茶叶机械智能科技股份有限公司；BSA224S型分析天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；SHZ-ш型循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂；DK-98-ц型电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；UV-6000T型紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司；Pacific TII 7 UV型超纯水机，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 单因素试验 依次进行不同浓度儿茶素提取物及其添加量、发酵时间、发酵温度的单因素试验，通过分析各因子对茶黄素生成量的影响，筛选较优参数。

1) 儿茶素提取物浓度及添加量。采摘福鼎大白茶树一芽1叶和一芽2叶鲜叶置于萎凋槽中萎凋至适度，将萎凋叶充分揉捻至适度即破损率在90%以上、成条率在80%以上，将揉捻好的揉捻叶分别称取11份、每份等量600 g，分别编号处理1～11，处理1～5分别按揉捻叶重量的1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%添加浓度为50%的儿茶素提取物(儿茶素提取物统一用70 mL 35℃纯净水溶解，下同)，处理6～10分别按揉捻叶重量的1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%添加浓度为80%的儿茶素提取物。处理11不添加儿茶素，添加等体积的35℃ 纯净水作空白对照。设定发酵温度30℃，发酵湿度99%，发酵3 h 后毛火110℃烘至6～7成干，摊凉1 h，足火80℃烘至足干。

2) 发酵时间。采摘福鼎大白茶树一芽1叶和一芽2叶鲜叶置于萎凋槽中萎凋至适度，将萎凋叶充分揉捻至适度即破损率在90 %以上、成条率在80 %以上，按最佳条件的儿茶素提取物浓度及添加量添加儿茶素，将揉捻好的揉捻叶分别称取6份，每份等量600 g，处理12～17分别按1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h设定发酵时间，发酵温度30℃，发酵湿度99%发酵，发酵完后毛火110℃烘至6～7成干，摊凉1 h，足火80℃烘至足干。

3) 发酵温度。采摘福鼎大白茶树一芽1叶和一芽2叶鲜叶置于萎凋槽中萎凋至适度，将萎凋叶充分揉捻至适度即破损率在90%以上、成条率在80%以上，将揉捻好的揉捻叶分别称取5份，每份等量600 g，按最佳条件的儿茶素提取物浓度及添加量添加儿茶素，处理18～22分别于20℃、24℃、28℃、32℃和36℃的发酵温度下，发酵湿度99 %，按照最佳发酵时间进行发酵，发酵完后毛火110℃烘至6～7成干，摊凉1 h，足火80℃烘至足干。

1.2.2 正交试验设计 在单因素试验获得较优值的基础上，设计儿茶素提取物添加量(A)、发酵时间(B)、发酵温度(C)的3因素3水平L9(34)正交试验，优化筛选外源儿茶素提取物添加量、发酵时间、发酵温度等。其因素水平见表1。

表1 添加外源儿茶素制备高茶黄素红茶的正交试验因素及水平

1.2.3 最佳工艺的验证 对正交试验中所得的最优组合进行验证，为工艺优化提供指导。

1.3 理化指标的测定

1.3.1 含水量 按照GB/T 8304-2013《茶水分测定》120℃快速烘干法进行测定。

1.3.2 茶黄素含量 参照《茶叶生物化学实验教程》中茶黄素的系统分析法[21]进行检测分析。

1.4 数据处理

所有试验均做3次重复，用WPS Office 2019整理试验数据，采用DPS7.05数据处理系统分析试验数据。采用最小显著差数法(LSD法)对试验中样品的茶黄素含量进行多重比较分析，以平均值±标准差为最后结果。在数据分析结果中，P<0.05表示差异显著，差异性用小写字母表示。

2 结果与分析

2.1 不同因素对茶黄素生成量的影响

2.1.1 儿茶素提取物浓度及添加量 从表2可知，添加相同儿茶素浓度但不同添加量时，茶黄素生成量均呈先增后降趋势。在儿茶素浓度为50%时，添加量为2.5% 的茶黄素生成量最大，为4.11 mg/g，与添加量分别为1.0%、1.5%和2.0%的差异显著，与添加量3.0%的无显著差异；在儿茶素浓度为80%时，添加量为2.0% 的茶黄素生成量最大，为3.82 mg/g，与添加量分别为1.0%、2.5%和3.0%的差异显著，与添加量1.5%的无显差异。对所有儿茶素提取物添加处理组比较分析可知，当儿茶素浓度为50%、添加量为2.5%时，茶黄素生成量最大，为4.11mg/g。表明，从茶黄素生成量看，儿茶素最佳添加浓度为50%、最佳添加量为2.5%。

表2 不同儿茶素提取物浓度及其添加量的茶黄素生成量

2.1.2 发酵时间 由图1可知，各处理组间茶黄素生成量无显著差异，随着发酵时间的延长，茶黄素生成量呈先升后降趋势，且发酵时间2.5 h时茶黄素生成量最大，为3.79 mg/g，可见2.5 h是最佳的发酵时间。

2.1.3 发酵温度 由图2可知，随着发酵温度的升高，茶黄素的生成量呈下降趋势，且在发酵温度20℃时，茶黄素的生成量最大，为5.36 mg/g，与其他处理差异显著；其余各处理间差异不显著，可见20℃是最佳发酵温度。

2.2 外源儿茶素制备高茶黄素红茶的正交试验结果

从表3可知，以茶黄素生成量为考察指标时，儿茶素添加量、发酵时间、发酵温度等3个因素对茶黄素生成量的影响依次为发酵温度>儿茶素添加量>发酵时间，理论最优组合为A3B1C2，即儿茶素浓度50%、添加量3.0%、发酵时间2 h、发酵温度24℃。正交试验9个处理组中，处理4(A2B1C2)即儿茶素浓度50%、添加量2.5%、发酵时间2 h、发酵温度 24℃时，茶黄素生成量最高，为6.72 mg/g，且与其他处理组间差异显著；茶黄素生成量次高的为处理9(A3B3C2)即儿茶素浓度50%、添加量3.0%、发酵时间3 h、发酵温度 24℃时，其茶黄素生成量为5.52 mg/g；茶黄素生成量最低的是处理1(A1B1C1)

表3 外源儿茶素制备高茶黄素红茶的正交试验结果

即儿茶素浓度50%、添加量2.0%、发酵时间2 h、发酵温度 20℃时，其茶黄素生成量为 1.51 mg/g。因此选取正交试验中的理论最优组合A3B1C2和实践中最优组合A2B1C2进行验证试验。

2.3 外源儿茶素制备高茶黄素红茶的最佳工艺条件

对A3B1C2和A2B1C2处理进行验证试验表明，以茶黄素生成量为参考指标时，采用A3B1C2工艺组合得到的茶黄素生成量为5.62 mg/g，采用A2B1C2工艺组合得到的茶黄素生成量为6.75 mg/g。所以，试验最终得到的最优组合为A2B1C2，即儿茶素浓度50%，儿茶素添加量2.5%，发酵时间2 h，发酵温度24℃。

3 结论与讨论

茶黄素是一类在红茶加工过程中由儿茶素类化合物氧化形成的物质，是红茶的主要品质成分之一，是使红茶呈现汤色亮及金圈的主要物质，也是红茶强度和鲜爽度的重要呈味物质。目前，用传统工艺加工出来的红茶中茶黄素含量较低，通过加工技术改良来提高红茶中茶黄素的含量是当前形势所需。提高茶黄素的途径有多种，如增加发酵过程中多酚氧化酶、过氧化物酶等酶的活性；在加工过程中引入冷冻处理，提高细胞膜的透性促进酶促氧化[7-8]；发酵中添加外源酶增强酶促反应的氧化能力[22-23]；儿茶素是生成茶黄素的酶促氧化反应的底物，在酶促反应中增加底物的量可有效促进反应，提高其含量[24-25]。研究旨在改良加工工艺，在红茶的发酵中按一定比例添加外源儿茶素提取物，增加底物的浓度，同时研究发酵温度和时间以促进茶黄素的形成。试验以35℃的温水溶解儿茶素提取物，确保儿茶素完全溶解使其与揉捻叶充分混匀[26]。试验中添加不同浓度和不同添加量的儿茶素处理组的茶黄素生成量均显著高于空白处理，说明添加儿茶素提取物能有效提高红茶中茶黄素的含量。在同一儿茶素浓度中随着添加量的增加，茶黄素的生成量呈先增后降趋势；在不同浓度条件下，试验中儿茶素浓度为50%、添加量为2.5%时茶黄素生成量最大，为4.11 mg/g；儿茶素浓度为80%，添加量为2.0%时茶黄素生成量最大，为3.82 mg/g；这一结果与曹冰冰等[15]的研究结果相符。在生成茶黄素的酶促反应中，儿茶素是底物，在一定范围内增大底物的浓度可有效提高反应生成物的含量，但在儿茶素氧化生成茶黄素的同时茶黄素也会发生进一步的氧化，茶黄素的生成量增大后会促进茶黄素的进一步氧化，且茶黄素的含量达一定值时会抑制氧化酶类的活性，使之含量降低[27-28]，可见底物浓度过大时，会抑制氧化酶类等的活性且促进茶黄素产物的进一步转化[28-29]。温度是发酵工艺中重要的影响因素之一，直接影响酶促反应中酶的活性。研究表明，随着发酵温度的升高，茶黄素的生成量呈下降趋势，且在发酵温度20℃时，茶黄素的生成量最大，为5.36 mg/g，主要是随温度的升高，儿茶素与茶黄素类物质的稳定性降低进而发生降解[30]，且超过一定温度范围酶活性会降低[31-32]，而低温有利于茶黄素的保留[33-34]，适当降低发酵温度可以提高红茶的品质，提高茶黄素的含量[35-36]。发酵时间是提升红茶品质的重要条件，发酵时间过短，酶促反应不充分，发酵时间过长，酶促反应氧化过度。研究表明，随着发酵时间的延长，茶黄素的生成量呈先升后降趋势，且发酵时间2.5 h时茶黄素生成量最大，为3.79 mg/g，这是由于发酵前期酶促反应为氧化生成茶黄素，在发酵适度后继续发酵使氧化过度，茶黄素发生酶促氧化生成茶红素、茶褐素类物质，发酵时间越长，茶黄素降解和转化的越多，适当缩短发酵时间，可以获得高浓度的茶黄素[36-37]。正交试验结果表明，发酵温度对茶黄素生成量的影响最大，儿茶素添加量的影响次之，发酵时间对生成量的影响最弱，考虑正交试验与验证试验中各处理组茶黄素的生成量与生产过程中的成本问题，高茶黄素红茶加工生产中的最佳工艺为儿茶素提取物浓度50%，儿茶素提取物添加量2.5%(重量比)，发酵时间2 h，发酵温度24℃。该条件下，可获得高含量茶黄素，达6.75 mg/g，与传统工艺相比，该工艺可有效增加红茶产品中茶黄素的含量，对红茶生产加工有一定参考价值。