狗枣猕猴桃 AkKCS蛋白的生物信息学分析

孙晶晶，陈 鑫，李然红，王立凤

(牡丹江师范学院，黑龙江 牡丹江 157012)

狗枣猕猴桃〔Actinidiakolomikta(Maxim. et Rupr.) Maxim.〕属猕猴桃科猕猴桃属大型落叶藤本植物，别名狗枣子。狗枣猕猴桃是我国东北地区最为耐寒的果树品种之一，是良好的抗寒育种资源，果实富含多种维生素及氨基酸，其中维生素C含量较高。狗枣猕猴桃在不同季节呈现白、粉、红、绿等不同颜色，是一种药食观赏兼用植物[1-3]。3-酮脂酰-CoA 合酶(KCS)是植物体超长链脂肪酸延伸过程中重要的限速酶，在整个延长循环中起十分重要的催化作用[4]。KCS蛋白作为转录因子，除了参与植物的生长发育，其中相当数量的成员在植物逆境响应中发挥重要功能。目前KCS基因已经在葡萄、拟南芥、滇牡丹、大豆、油菜、油茶、油桐等植物中被发现，并在相关领域研究取得一定成果[5]。陈柳等[6]在油菜种子中转入KCS基因后发现，KCS基因能大幅提高种子中芥酸含量；HAN等[7]研究发现，KCS基因参与植物花和幼叶的表达，超表达能够导致植株矮小、发育迟缓。笔者课题组首次在狗枣猕猴桃转录组中发现AkKCS基因，目前未见狗枣猕猴桃AkKCS蛋白的报道。鉴于此，以狗枣猕猴桃转录组为参考，筛选到AkKCS基因的cDNA序列，利用生物信息学方法对AkKCS蛋白的理化性质、疏水性/亲水性、功能域、二级结构、三级结构、蛋白质修饰位点及同源性等进行预测和分析，旨在为深入研究狗枣猕猴桃AkKCS蛋白功能提供依据，并探明狗枣猕猴桃AkKCS蛋白与其抗寒性的内在联系。

1 材料与方法

1.1 材料来源

狗枣猕猴桃AkKCS蛋白的cDNA序列数据来自于牡丹江师范学院遗传育种实验室转录组数据；中华猕猴桃变种(Actinidiachinensisvar.chinensis，PSS33602.1)、圆叶杜鹃(Rhododendronwilliamsianum，KAE9466640.1)、小果咖啡(Coffeaarabica，XP_027078202.1)、中粒咖啡(Coffeacanephora，CDP02779.1)、烟草(Nicotianatabacum，XP_016437717.1)、紫花风铃木(Handroanthusimpetiginosus，PIM97319.1)、橡胶树(Heveabrasiliensis，XP_021637941.1)、林烟草(Nicotianasylvestris，XP_009786212.1)、芝麻(Sesamumindicum，XP_011099559.1)、绒花烟草(Nicotianatomentosiformis，XP_009598968.1)、花生(Arachishypogaea，XP_025676000.1)、麻疯树(Jatrophacurcas，XP_012082087.1)等12种植物氨基酸序列在NCBI数据库中下载。

1.2 方法

AkKCS蛋白的理化性质及等电点利用ProtParam和ProtScale预测，跨膜结构分析采用Signal P-4.1方法，保守结构域、二级结构和三级结构借助于NCBI-CDD、PredictProtein及SWISS-MODEL在线工具进行分析，同源性通过MAGA 5.1进行分析。分析工具及网络地址详见表1。

表1 AKLEA2蛋白的生物信息学分析工具及网址

2 结果与分析

2.1 AkKCS蛋白的理化性质

对AkKCS氨基酸序列预测结果表明，AkKCS蛋白开放阅读框为1 693 bp，编码496个氨基酸，分子式为C2533H4038N680O691S28，分子量5 5971 Da，理论pI为9.33，不稳定指数为40.75，脂肪系数为99.07，亲水性平均水平0.011。AkKCS蛋白(氨基酸)中亮氨酸含量最多，其次为异亮氨酸，含量最少的为色氨酸。亲水/疏水性分析结果(图1)表明，AkKCS蛋白的整个肽链中均含有亲水性和疏水性氨基酸，得分最大值为3.100，在75个氨基酸处；得分最小值为-3.689，在第287个氨基酸处。综合分析认为，狗枣猕猴桃AkKCS为亲水性不稳定蛋白。

2.2 AkKCS蛋白的跨膜结构预测

预测AkKCS蛋白结果(图2)显示，C、S、Y值均没有出现明显峰值，因此判断该蛋白不存在跨膜结构。

2.3 AkKCS蛋白的结构域预测

NCBI-CDD序列的比对结果(图3)表明，狗枣猕猴桃AkKCS蛋白为3-酮脂酰-CoA合酶KCS基因家族的成员(ID:PLN03212)之一，其保守结构域及功能位点位于第80～454氨基酸之间的序列区域，第80～368氨基酸之间含有FAE1合酶保守结构及其他查尔酮合酶保守结构域。

2.4 AkKCS蛋白的二级、三级结构预测

对AkKCS蛋白的二级结构预测结果表明，螺旋(Helix)为该蛋白的主要结构，占比50.2%；无规卷曲(Random coil)占比31.45%，延伸链(Strand)占比13.31%，5.04%为转角(Turn)结构，没有特殊结构。对AkKCS蛋白三级结构预测结果(图4)表明，螺旋及无规卷曲为其主要结构，其在第80～368氨基酸附近含有位点功能。

2.5 氨基酸序列的同源性对比

狗枣猕猴桃AkKCS氨基酸序列与中华猕猴桃变种、圆叶杜鹃、小果咖啡、中粒咖啡、烟草、紫花风铃木、橡胶树、林烟草、芝麻、绒花烟草、花生、麻疯树等12种植物的KCS序列同源性分析结果(图5)表明，狗枣猕猴桃AkKCS与中华猕猴桃原变种及圆叶杜鹃亲缘关系较近，而与烟草等植物亲缘关系较远。

3 结论与讨论

3-酮脂酰-CoA 合酶(KCS)是植物体超长链脂肪酸延伸过程中重要的限速酶，广泛存在于植物体当中，葡萄、油菜、大豆、拟南芥中均已发现KCS基因，并被克隆及表达[8]。该研究首次在狗枣猕猴桃转录组数据中发现KCS基因，并对其进行生物信息学分析表明,AkKCS蛋白cDNA全长为1 693 bp，共编码496个氨基酸，分子式为C2533H4038N680O691S28，分子量55 971 Da，属于亲水性不稳定蛋白，氨基酸含量多为亮氨酸和异亮氨酸，色氨酸含量较少。不含信号肽及跨膜结构，属于3-酮脂酰-CoA合酶KCS基因家族的成员(ID:PLN03212)，具有KCS的保守结构域。二级结构以螺旋为主，与三级结构预测结果相符。AkKCS氨基酸序列与中华猕猴桃原变种及圆叶杜鹃亲缘关系较近，与烟草及其他植物亲缘关系较远。研究结果可为狗枣猕猴桃AkKCS基因功能进一步分析提供一定理论基础。