外源茉莉酸甲酯对烟草幼苗耐冷性的影响

张海枞，邢雪霞，牛莉莉，鲁宇童，张 林，刘 园*

(1.河南省烟草公司 南阳市公司，河南 南阳 473000； 2.河南中烟工业有限责任公司，河南 郑州 450000； 3.红云红河集团 昆明卷烟厂，云南 昆明 650000)

茉莉酸甲酯(MeJA)是脂质衍生化合物，是植物应激反应和发育的关键信号化合物，在植物生长发育过程中具有重要的影响[1]。茉莉酸(JA)及其衍生物由在叶绿体膜的半乳糖脂中酯化的α-亚麻酸合成，物理损伤与逆境环境刺激可导致α-亚麻酸的产生与释放，从而增加植物体内茉莉酸的含量。LIU等[2-5]研究发现，喷施外源MeJA能够增强植株对低温的抗性，使植株的抗氧化酶活性提高、丙二醛含量下降，也可通过提高抗寒转录因子的表达量从而提高植株的抗寒性，保护低温下细胞的超微结构。MeJA还参与腺毛的分泌，腺毛对植株防御干旱及低温等逆境具有重要作用[6]。

烟草是原产于热带亚热带的喜温作物，低温环境严重影响其生长发育[7]。低温下叶绿体类囊体膜通透性增强致使细胞脱水及离子外泄，导致膜结构受损和膜脂过氧化等不良影响。随着低温环境时间的延长，叶绿体形态发生变化，光合色素含量显著降低，进而使细胞代谢紊乱，当细胞内的运转平衡被破坏时，细胞便会萎蔫，最终导致生长受阻。近年来，温度变化趋势使得低温环境愈发严峻，已成为限制作物生长和农业可持续发展的环境因素[8-9]。K326和豫烟6号是河南烤烟生产的主栽品种，K326适应性较强，产质量较高，烟叶化学成分较协调[10]，但对低温环境较为敏感[11]。豫烟6号的外观质量和感官质量较好，具有一定的抗旱性和抗病性[12]，但对其低温敏感程度未见系统的研究报道。为此，采用营养液培养法，研究外源MeJA对K326与豫烟6号幼苗耐冷性的影响，旨在进一步阐明外源MeJA应对低温胁迫的生理机制，进而为MeJA在烟草幼苗上的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 烤烟品种 河南烤烟生产的主栽品种K326和豫烟6号(Y6)，由河南农业大学烟草学院提供。

1.1.2 试剂 95%茉莉酸甲酯(MeJA)，Sigma试剂公司；过氧化氢、甲硫氨酸、氮蓝四唑、核黄素、愈创木酚、硫代巴比妥酸、酸性茚三酮、冰乙酸和蒽酮，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器 酶联免疫检测仪，瑞士TECAN集团公司；台式离心机，德国Eppendorf国际贸易有限公司；电子天平，上海精密仪器仪表有限公司；便携式Li-6400红外气体分析仪，Li-COR,Inc,Lincoln,NE,USA。

1.2 方法

1.2.1 播种及培养条件 烟草种子分别先用10%过氧化氢消毒8 h，再用纯水冲洗干净后播种。培养介质为育苗盘和潮湿的工字格海绵，水培营养液为Hoagland营养液；人工气候培养箱环境：昼夜(28±2)℃/(18±2)℃，光周期为14 h/10 h循环，相对湿度70%，光照强度为22 000 lx。

1.2.2 试验设计 当烟草长至4叶一心幼苗时将其移至蛭石中生长，保证其根部有足够大的生长空间。在烟草幼苗长至6叶一心时选取长势一致的幼苗移至水培盒采用营养液培养。采用单因素随机试验设计，2个品种试验处理完全相同，试验共设4个处理：CK，正常温度，喷施等量清水；处理1，MeJA喷施浓度为0 μmol/L(即喷施等量清水)，处理2，MeJA喷施浓度为10 μmol/L；处理3，喷施MeJA浓度为100 μmol/L。3次重复，每个重复3株烟苗。处理1～3进行3 d正常温度预处理，然后进行5 d低温处理(低温环境为昼夜11℃/8℃[13-14])，其余条件不变。在此生长期间每3 d换1次营养液，通氧2 h/d，在低温处理的第5天分别选取2片真叶测定各生理生化指标。

1.2.3 指标测定

1) 烟草幼苗叶片鲜重、饱和重、干重及相对含水量。低温处理第5天后称量幼苗鲜重，然后放入清水中浸泡24 h充分吸水达到饱和后，测量其饱和重。再将幼苗先放入105℃烘箱杀青30 min，接着于70℃环境中烘干48 h至恒重后称量其干重。通过鲜重、饱和重和干重计算叶片的含水量[15]和相对含水量。

含水量=(鲜重-干重)/鲜重×100%

相对含水量=(鲜重-干重)/(饱和重-干重)×100%

2) 抗氧化酶活性。取相同叶位叶片0.5 g，加入预冷的5 mL pH 7.8的磷酸缓冲液进行冰浴研磨，并冷冻离心20 min，上清液即酶活性提取液，于4℃冰箱中低温保存。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)参照文献[16]的方法测定。

3) 丙二醛、脯氨酸和可溶性糖。称取相同叶位烟草叶片0.5 g测定不同渗透调节物质。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[17]测定，脯氨酸(Pro)含量采用酸性茚三酮比色法[18]测定，可溶性糖(WSS)含量采用蒽酮比色法[19]测定。

4) 光合作用参数。使用便携式Li-6400红外气体分析仪在低温处理5 d时，从9:00-11:00对烟株自上而下第3片完全展开叶进行光合数据的测定，保持叶室温度维持在26～29℃，光强为 800 μmol/(m2·s)，CO2浓度为 400 μmol/mol。直接测定叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)，并计算叶片水分利用率(WUE)和气孔限定值(Ls)。

WUE=Pn/Tr

Ls=1-Ci/Co

式中，Co为CO2的设定浓度。

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2010和SPSS 19.0对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 外源MeJA处理低温下2个烟草品种幼苗的生物量及相对含水量

从表1可知，不同处理低温下K326和Y6的鲜重、干重和相对含水量的变化。K326：鲜重、干重和相对含水量均以CK最大，分别为24.14 g、2.33 g和87.96%；处理1最小，分别为10.35 g、1.54 g和78.55%；鲜重CK显著大于其余处理，其余处理间差异显著；干重CK显著大于其余处理，处理1与处理2间和处理2与处理3间差异不显著；相对含水量CK显著大于其余处理，处理1显著小于其余处理，处理2与处理3间差异不显著。Y6：鲜重、干重和相对含水量均以CK最大，分别为25.41 g、2.22 g和88.86%；处理1最小，分别为11.72 g、1.55 g和79.37%；鲜重CK显著大于其余处理，其余处理间差异显著；干重和相对含水量CK均显著大于其余处理，处理1显著小于其余处理，处理2与处理3间差异不显著。

表1 不同浓度外源 MeJA处理低温下2个烤烟品种幼苗的生物量及相对含水量

2.2 外源 MeJA处理低温下2个烟草品种幼苗的抗氧化酶活性

从图1看出，不同处理低温下K326和Y6幼苗的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性的变化。

2.2.1 K326 SOD，处理3最高，为204.35 U/g FW；CK最低，为51.92 U/g FW；处理3>处理2>处理1>CK；各处理间差异显著。POD，处理2最高，为41.95 U/(g·min FW)；CK最低，为27.74 U/(g·min FW)；处理2>处理3>处理1>CK；CK显著低于其余处理，处理2与处理3显著高于处理1，二者间差异不显著。CAT，处理2最高，为33.76 U/(g·min FW)；CK最低，为9.50 U/(g·min FW)；处理2>处理3>处理1>CK；各处理间差异显著。

2.2.2 Y6 SOD、POD和CAT均以处理2最高，分别为212.54 U/g FW、47.03 U/(g·min FW)和35.85 U/(g·min FW)；CK最低，分别为55.55 U/g FW、30.15 U/(g·min FW)和10.45 U/(g·min FW)；均为处理2>处理3>处理1>CK；SOD、POD和CAT的各处理间差异显著，CK显著低于各处理，处理2显著高于其余处理。

2.3 外源 MeJA处理低温下2个烟草品种幼苗可溶性糖(WSS)、丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)含量的影响

从图2看出，不同处理低温下K326和Y6幼苗的可溶性糖(WSS)、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量的变化。

2.3.1 K326 WSS和MDA均以处理1最高，分别为1.79%和2.89 μg/g Fw；CK最低，分别为0.29%和0.03 μg/g Fw；均为处理1>处理2>处理3>CK；各处理间差异显著。Pro处理1最高，为1.58 μmol/g FW；CK最低，为0.09 μmol/g FW；处理1>处理3>处理2>CK；处理1显著高于其余处理，CK显著低于其余处理，处理2与处理3差异不显著。

2.3.2 Y6 WSS、Pro和MDA均以处理1最高，分别为1.66%、1.41 μg/g Fw和2.63 μmol/g FW；CK最低，分别为0.31%、0.09 μg/g和0.03 μmol/g FW；均为处理1>处理3>处理2>CK；各处理间差异显著。

2.4 外源 MeJA处理低温下2个烟草品种幼苗光合作用参数的变化

从表2看出，不同处理低温下K326和Y6幼苗的净光合速率、气孔导度和胞间CO2浓度等光合作用参数的变化。净光合速率：K326和Y6分别为11.85～21.96mmol/(m2·s)和12.89～21.99 mmol/(m2·s)，均为CK>处理2>处理3>处理1；各处理间差异显著。气孔导度：K326和Y6分别为0.23～0.50mmol/(m2·s)和0.25～0.51 mmol/(m2·s)，均为CK>处理2>处理3>处理1；各处理间差异显著。胞间CO2浓度：K326和Y6分别为326.26～357.47 μmol/mol和325.67～354.17 μmol/mol，均为处理1>处理3>处理2>CK；K326各处理间差异显著，Y6处理2与处理3间差异不显著，二者与其余处理间差异显著。蒸腾速率：K326和Y6分别为3.67～5.26 mmol/(m2·s)和3.68～5.31 mmol/(m2·s)，均为CK>处理2>处理3>处理1；各处理间差异显著。水分利用效率：K326和Y6分别为3.23～4.17 μmol/mol和3.50～4.14 μmol/mol，均为CK>处理2>处理3>处理1；K326各处理间差异显著，Y6处理2与处理3间差异不显著，二者与其余处理间差异显著。气孔限定值：K326和Y6分别为0.11～0.18和0.11～0.19，均为CK>处理2>处理3>处理1；K326各处理间差异显著，Y6处理2与处理3间差异不显著，二者与其余处理间差异显著。

表2 不同浓度外源处理 MeJA低温下2个烟草品种幼苗光合作用参数的变化

3 结论与讨论

茉莉酸甲酯(MeJA)作用的主要机理是提高抗氧化酶的活性降低低温造成的活性氧积累，进而使细胞保持完整性。研究结果表明，MeJA是响应胁迫环境的信号分子，能够有效地抑制K326和Y6幼苗在低温环境下的损伤，低温下2个品种幼苗的生长发育均会受到不同程度的抑制，Y6抵御低温的能力略好于K326。K326和Y6的鲜重、干重和相对含水量均以正常温度处理最大，分别为24.14 g、2.33 g、87.96%和10.35 g、1.54 g、78.55%；低温MeJA 0 μmol/L最小，分别为10.35 g、1.54 g、78.55%和11.72 g、1.55 g、79.37%。K326的超氧化物歧化酶(SOD)为低温MeJA 100 μmol/L>低温MeJA 10 μmol/L>低温MeJA 0 μmol/L>正常温度，过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)均为低温MeJA 10 μmol/L>低温MeJA 100 μmol/L>低温MeJA 0 μmol/L>正常温度；Y6的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性均为低温MeJA 10 μmol/L>低温MeJA 100 μmol/L>MeJA 0 μmol/L>正常温度。

渗透调节物质在植物逆境胁迫中占有重要位置，其指标含量表示对逆境的反应程度[20]。丙二醛(MDA)作为脂质过氧化指标，用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境反映的强弱。研究结果表明，K326的可溶性糖(WSS)和丙二醛(MDA)含量均为低温MeJA 0 μmol/L>低温MeJA 10 μmol/L>低温MeJA 100 μmol/L>正常温度，Pro为MeJA 0 μmol/L>MeJA 100 μmol/L>MeJA 10 μmol/L>正常温度。Y6的WSS、Pro和MDA均为MeJA 0 μmol/L>MeJA 100 μmol/L>MeJA 10 μmol/L>正常温度。表明，茉莉酸甲酯能够促进低温下烟草对可溶性糖和脯氨酸的积累，减少丙二醛的积累。

研究结果表明，K326和Y6幼苗在低温环境下的SOD、POD和CAT含量都显著上升，并且在10 μmol/L MeJA处理时二者的抗氧化酶系统含量达最高。即外源MeJA的喷施会进一步增强信号传导，使得抗氧化酶含量迅速上升，以减少脂膜过氧化的产生。渗透调节物质也是缓解逆境的重要组成成分[21]。可溶性糖、脯氨酸能够维持酶结构的稳定和细胞渗透势的水平，陈璇等[22]研究表明，短时间的低温胁迫下，植物细胞组织液渗透浓度越高，其对寒冷的响应速度越快，抗寒性越强。丙二醛是衡量植物胁迫情况下生长状况重要的生理指标。试验结果表明，低温下外源MeJA处理能够提高可溶性糖和脯氨酸的积累，使其含量维持在较高的水平，增加细胞的持水力，防止植物组织受到冷害，也减少其MDA含量，有利于植物维持一定的渗透势进而提高烟草幼苗的耐冷性。

光合作用是植物生长发育、积累干物质和产量形成的基础，低温环境会对光合作用产生不良影响。徐田军等[23]研究表明，在低温环境下导致光合作用降低的原因有两方面：一是在轻度低温胁迫时，气孔因素导致植物光合作用降低，主要是植株叶片气孔扩散的阻力增加，气孔导度降低，进而吸收的二氧化碳含量降低，使产物运输途径受阻，最终导致净光合速率下降；二是在重度胁迫时，非气孔因素导致植物光合作用降低，具体表现为当光化学活性和RUBP羧化等受到限制时，阻碍二氧化碳的利用，从而造成细胞中的二氧化碳含量积累，而净光合速率、气孔导度仍然呈下降趋势。胞间二氧化碳浓度的变化趋势随着胁迫时间的长短而变化，通常呈先降后升趋势。研究结果表明，在低温环境处理5 d后，K326和Y6不同处理净光合速率分别为11.85～21.96 mmol/(m2·s)和12.89～21.99 mmol/(m2·s)，均为正常温度>低温MeJA 10 μmol/L>低温MeJA 100 μmol/L>低温MeJA 0 μmol/L；胞间CO2浓度分别为326.26～357.47 μmol/mol和325.67～354.17 μmol/mol，均为低温MeJA 0 μmol/L>低温MeJA 100 μmol/L>低温MeJA 10 μmol/L>正常温度；蒸腾速率分别为3.67～5.26 mmol/(m2·s)和3.68～5.31 mmol/(m2·s)，均为正常温度>低温MeJA 10 μmol/L>低温MeJA 100 μmol/L>低温MeJA 0 μmol/L；水分利用效率分别为3.23～4.17 μmol/mol和3.50～4.14 μmol/mol，均为正常温度>低温MeJA 10 μmol/L>低温MeJA 100 μmol/L>低温MeJA 0 μmol/L；气孔限定值分别为0.11～0.18和0.11～0.19，均为正常温度>低温MeJA 10 μmol/L>低温MeJA 100 μmol/L>低温MeJA 0 μmol/L。气孔的关闭虽然也是低温造成叶片光合速率降低的原因，但胞间CO2浓度的上升和气孔限定值的下降表明，烟草叶片光合速率下降的主要原因是叶肉细胞光合活性降低以及非气孔因素所致，与卫丹丹等[24-25]的研究一致。说明经低温胁迫后，2个品种的光合作用降低，而外源MeJA能够对烟草幼苗的光合机构起保护作用；MeJA能够抵抗低温胁迫。K326在外源MeJA浓度为100 μmol/L时光合参数最接近正常温度处理，Y6在外源MeJA浓度为10 μmol/L时光合参数最接近正常温度处理。2个品种的光合参数与生物量、相对含水率变化程度一致，说明不同的品种对外源物质存在剂量效应。