PCR仪与测序仪应用于丙型肝炎病毒基因型检测的临床效果观察

宋树森 李强 谷海峰 王岩 沈阳市第六人民医院 （辽宁 沈阳 110006）

内容提要：目的：观察PCR仪与测序仪在丙型肝炎病毒（HCV）基因型检测中的应用。方法：选择2018年1月～2018年12月收治的134例HCV感染患者为研究对象，给予患者PCR仪检测、测序仪检测。结果：测序仪检测134例均可分型，PCR仪检测130例患者可分型，4例未能分型。PCR检测结果：134例HCV感染患者中，1b型59例，2a型47例，3a型6例，3b型15例，6a型3例，4例为分出型别。基因测序结果：134例均可分型：1型59例，2a型40例，2i型7例，3a型6例，3b型15例，6a型3例，6n型4例。PCR仪检测法检测符合率97.0%。结论：PCR仪测序仪检测用于丙型肝炎病毒基因型检测，操作便捷，但其只能检测探针覆盖的型别，个别罕见型别不能分型。

作为慢性肝病的主要病因之一，HCV感染的危害已经引起了人们的广泛重视[1]。HCV基因型检测是临床控制HCV感染的基础[2]。由于不同基因亚型病毒感染引发的临床表现各异，治疗方案亦有所差别。因此，需要通过对HCV感染患者的精确基因型检测，为其临床治疗提供良好的支持。

1.资料与方法

1.1 临床资料

纳入2018年1月～2018年12月本院收治的134例HCV感染患者为研究对象。其中，男86例，女58例；年龄（36.9±12.5）岁。

仪器与试剂：实时荧光PCR仪（ABi 7500），测序仪（ABi 3130基因测序仪），丙型肝炎病毒（HCV）基因分型检测试剂盒（PCR-荧光探针法）由泰普生物科学（中国）有限公司提供，丙型肝炎病毒（HCV）基因分型检测试剂盒（DNA测序法）北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司提供，HCVRNA提取试剂盒（QIAamp Viral RNA Mini Kit，德国Qiagen公司）。

1.2 方法

1.2.1 PCR检测

①取样。取118例HCV感染患者2mL空腹静脉血，以3000r/min速度，持续离心处理10min，获得血清标本，置于-80°C温度冰箱内保存。②核酸提取。血清样本按照QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒说明书进行核酸提取纯化。③PCR检测。分别取各亚型HCV RT-PCR反应液38×（n+2）μL和酶系2×（n+2）μL，（n等于首检样本数），混匀，各管分别按40μL/管分装到PCR反反管中。再在各亚型HCV RT-CR反应液中分别加入25μL矿物油。HCV RNA或质控品的提取产物各10μL。混匀，放入PCR仪，按下列程序条件扩增：42°C 30min；95°C 3min；再按94°C 20S→55°C 20S→72°C 30S，循环10次；再按94°C 15S→60°C 45S，循环30次。④结果判读。如果检测样本无典型S扩增曲线或Ct值＞26.5，则判样本为HCV 1b、2a、3a、3b和6a阴性；如果检测样本呈典型S曲线且Ct值≤25.1，则根据说明书提供的表格判断样本的亚型。

1.2.2 测序检测

①HCV-RNA标本制备。选择德国Qiagen QIAamp病毒RNA抽提试剂盒从HCV感染患者的200μL血清标本中提取HCV病毒RNA，将病毒RNA置于-80°C环境下保存待检。②基因扩增。选择HCV 感染患者的HCV NS5B 基因区域作为测序重点，扩增方法选择反转录方法。扩增完毕通过扩增曲线判断是否扩增成功。将扩增成功的片段纯化，然后进行测序反应，产物再次纯化后准备上级。③测序。将纯化产物加入96孔板，过夜检测。④分析。将测序片段提交到NCBI网站进行基因分型分析（www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi）。

1.3 观察指标

统计两种检测方法的基因型检测结果；对比两种检测方法的检测符合率。

1.4 统计学分析

以SPSS23.0软件统计。P＜0.05，差异显著。

2.结果

2.1 基因型检测结果

测序仪检测134例患者均可分型，而PCR检测130例可分型，另外4例患者未能分型。

测序检测结果：134例HCV感染患者中：1型共77例，1型59 例，2a型40 例，2i型7 例，3a型6 例，3b 型15 例，6a型3例，6n型4例。HCV基因型主要为1b型和2a型，二者占比之和达73.9%。其中2i型和6n型为PCR法检测不到的。

PCR检测结果：134例HCV感染患者中，1b型59例，2a型47例，3a型6例，3b型15例，6a型3例，4例为分出型别。同样以1b型和2a型为主。

2.2 检测符合率

以本组134例HCV感染患者的基因型一代测序检测结果为金标准，评估PCR仪检测的符合率，结果提示：PCR仪检测法对HCV感染患者基因型的检测符合率为97.0%（130/134）。

3.讨论

随着临床关于HCV感染研究的不断深入，HCV基因型检测已经成为这一领域研究的主要方向之一[3]。不同的基因型，所应用的治疗手段与治疗周期都是不同的。目前可用于HCV基因型检测的方法较多，如异源分子迁移率分析法、测序法、PCR分析法，斑点杂交法等[4]。其中，测序法是临床开展HCV基因分型的金标准。这种检测方法可保障HCV感染患者的基因型检测结果的准确性，但其存在耗时较长、检测过程繁琐等不足[5]。

相对于其他检测技术而言，PCR技术是一种具有典型高效性、便捷性特征的检测方法。将其用于HCV感染患者的基因型检测，可于检测2～3h内获取检测结果。虽然这种检测方法的灵敏度水平较高，但由于引物的限制，其在区分部分罕见HCV的基因时，可能会出现检测失败。同时，对于2a型和2i型不能分辨，但由于这两种基因型生物学特性较一致，所以可以忽略。此外，本研究证实：PCR检测HCV感染基因型的符合率为97.0%。这一结果提示：这种检测方法在基因分型准确性方面良好。

综上所述，相对于测序仪检测而言，PCR仪在HCV基因型检测便捷性方面具有明显优势，且这种检测方法的符合率良好。因此，在HCV感染患者的基因型检测中，可将PCR仪检测结果作为参考。