牛轮状病毒研究进展

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

牛轮状病毒（Bovine rotavirus，BRV）属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是导致犊牛腹泻的主要病原之一[1]，有近半的新生犊牛腹泻与BRV感染有关。该病毒可引起1～7日龄犊牛精神沉郁、酸中毒，并会出现食欲废绝及水样腹泻等临床症状[2]。感染的犊牛经常伴有牛冠状病毒(Bovine coronavirus，BCV)及大肠杆菌（Colibacillus）感染导致死亡。该病在全球的养牛国家和地区流行，给养牛业造成了严重的经济损失[3]。新生犊牛BRV发病率为60%～80%，死亡率也高达30%[4]。对BRV的研究虽已较久，但始终未研制出特效治疗药物，更无有效的疫苗预防[5]。BRV对新生动物感染的潜伏期很短，表现为大量腹泻和严重脱水，同时感染继发性病原体会加重疾病的发展程度。BRV感染的诊断依赖于常规技术，如MA104细胞系的分离、电子显微镜、电镜分型和各种血清学检查。目前，更多地利用RTPCR、测序或基因组杂交技术进行诊断和分子分型，由于BRV具有极高的遗传多样性，故根除该病原体往往是困难的。因此，为了预防该病，必须加强管理措施，加快疫苗的开发及应用。近年来，包括DNA疫苗、亚单位疫苗、类病毒颗粒(VLPs)和食用疫苗已被发现能诱导一定程度的被动免疫[6]。除感染犊牛外，还需要了解BRV的人畜共患病。本文对BRV进行概括性综述，为将来进一步研究动物模型的建立[7]及疫苗的研发提供依据。

1 病原特征

根据VP4和VP7蛋白上的抗原不同，可将RV分成G型和P型。现阶段BRV疫苗及评估的BRV跨物种间传播均根据G型和P型差异研究的，特定的G型和P型与其物种有关，如BRV血清型的有G1、G6、G8、G10和G15，其中以G6和G10血清型最为常见[8]，并且还包括P1、P5和P11型，而人轮状病毒（HRV）最常见G1、G2、G3和G4型。随着世界各地RV种类的增多，P型和G型宿主种类的特异性已变得不那么明显，BRV特有的G6、G8和G10已在人类身上发现[9]。

2 病毒复制及感染机制

BRV经口腔途径进入机体后，可在成熟的上皮绒毛细胞中复制。由于病毒具有高效的定植性和传染性，病毒的外层衣壳需要被割除，而该物质是由肠道蛋白酶即糜蛋白酶促进的。在细胞培养过程中，经过胰蛋白酶处理的病毒感染性会增强。最先被感染的是十二指肠绒毛上皮细胞，它们释放大量的病毒，继而扩散到小肠近、远端的肠细胞[10]。病毒在小肠上皮细胞中开始复制后，其发病机制就开始了，并通过去除外层衣壳蛋白激活RNA聚合酶，转录产生mRNAs的正链RNA分子，并在细胞质中被翻译或作为复制的模板。在病毒增殖过程中，成熟的肠细胞脱落，逐渐被隐窝的未成熟细胞覆盖，导致吸收和分泌的比率发生变化，从而导致液体在肠腔内积聚，由于替代的细胞为立方或鳞状细胞，缺乏吸收、转运和分泌等功能，成熟肠细胞的丢失也会导致碳酸氢钠、钾、氯化物和水的消耗，最终导致酸中毒。以上因素加上肠道上皮的炎症变化，都会导致幼龄动物腹泻。

目前，BRV腹泻可能是由于成熟的小肠细胞被破坏，导致活性物质激活肠神经系统等机制引起的，也可能是由病毒肠毒素NSP4的分泌引起的[11]，NSP4改变了钙依赖性细胞的通透性，增加了氯化物的分泌[12]。此外，BRV通过调节干扰素和其他细胞因子而产生免疫逃逸机制也是现今研究的一大热点[13]。Chauhan等发现细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在清除RV感染中具有重要作用，Malik等发现辅助T细胞（TH）通过诱导B淋巴细胞反应，在清除RV时也发挥着至关重要的作用。因此，B淋巴细胞和T淋巴细胞都参与RV的免疫生成，B细胞分泌特异性IgA和IgG抗体，而CTL直接清除宿主病毒[14]。

在疾病进展的后期，随着绒毛的恢复，肠细胞再生，从腹泻中恢复的受感染者可在感染后10～28d内恢复正常。此外，成熟的肠道细胞也分泌抗菌物质，这些化合物对防止细菌入侵具有重要意义[15]。

3 流行病学

BRV主要感染新生犊牛，A组RV占牛群感染的绝大部分，A组轮状病毒（Rotavirus，RV）是新生婴儿及幼龄动物腹泻的一个重要原因。这种病毒可以在粪便中或饲养围栏中存活几个月，并对多种消毒剂具有抗药性，导致感染的持续存在。BRV难以被控制的主要原因也包括其具有复杂的流行病学情况，病毒不同的血清型在一个区域内由于基因转移或基因组重组而循环着。调查发现犊牛BRV的感染率和流行率在7%～98%之间，平均感染率为30%～40%，而在美国感染率高达98%，意大利BRV感染率也在90%左右[16]。

4 诊断

临床诊断并不能对BRV感染做出准确判断，因此选择一种快速、准确的检测方法对控制病毒传播具有重要意义。通常BRV的检测是基于肠道内容物或粪便中病毒的分离和鉴定：在RV特异性细胞系MA 104上进行BRV的分离，并通过电子显微镜直接进行检测；免疫荧光试验、免疫过氧化物酶试验和病毒RNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳、乳胶凝集试验也可用于检测病原体；酶联免疫吸附试验是一种高度敏感和特异的检测方法，已被许多研究学者开发用于BRV的鉴定；还有一种快速的斑点免疫分析方法，可直接将抗原应用于硝化纤维素膜，然后在几小时内检测抗原-抗体复合物；近年来，RT-PCR扩增VP4或VP7基因的方法被广泛应用；多重PCR的方法也已经成熟，可用于多种病原体的检测。此外，还可以根据基因的测序区分不同的BRV分离株。

5 预防与治疗

良好的管理和卫生防范有助于减少BRV腹泻的发病率，同时使用抗生素可以有效控制继发性细菌感染。通过摄入含抗体初乳可以保护新生犊牛免受BRV感染，少量抗体进入血液循环，大多数仍保留在肠道内。对犊牛的保护效果主要取决于肠道内是否存在一定量的BRV特异性抗体。犊牛血清中的抗体滴度被认为是检测BRV感染的一个指标。在牛的免疫接种过程中，将肌肉注射和乳内注射相结合，可以显著提高抗体滴度。含有BRV特异性免疫球蛋白、乳清和植物油的初乳经人工饲喂犊牛后能提高机体对病毒的抵抗力，也有报道称鸡蛋黄免疫球蛋白可以保护新生犊牛免受BRV感染。此外，添加益生菌也可以预防RV引起的幼龄动物腹泻[17]。

6 BRV的种间传播

Cruvinel等证实BRV具有种间传播的能力[18]，可以在犊牛、羔羊及仔猪中相互传播。Kumar等研究发现接种其他动物或人RV的犊牛可以产生抗体保护，抵御BRV的攻击，证明了他们之间存在密切的关系[19]。Yang等报道，BRV对仔猪也同样具有影响，发现犊牛感染BRV之后与仔猪接触，仔猪会发生临床症状，通过检测可以确定仔猪排毒，其原因是仔猪直接接触了带毒的犊牛粪便[20]。研究发现，BRV与兔之间也存在相互感染，兔子接触带毒的粪便也会受到感染。同样，Grazia等报道猫、犬等宠物也可能排出BRV，并被认为在BRV的传播中起着作用。Wani等也记载了BRV向禽类传播的病例[21]。此外，利用不同基因组制备的探针进行杂交实验和序列分析，为RV进化过程中物种间的传播提供了充分的证据。Shahrabadi等认为，在一种动物中流通的RV，由于出现的一种重组病毒，可能会对另一种动物造成危险[22]；Khamrin等发现BRV G4、G5、G6和G8的血清型分别与人、猪和骆驼的RV密切相关，这表明牛等动物可能在人类和其他动物感染RV上发挥着关键作用[23]。

7 BRV的人畜共患病意义

因为动物和人类存在交集，所以动物轮状病毒对人类存在潜在威胁。BRV与HRV交互感染在婴儿腹泻病例时有发现，这表明动物轮状病毒具有显著的人畜共患性。人畜共患病传播的主要原因是人与家畜之间的密切接触，尤其是经常出现洪水或暴雨的地区，水和粮食也有可能通过动物排泄带有RV的粪便而污染。同样，动物RV也可以通过吃生的食物传播。为了进一步了解BRV来源的流行病学和遗传基础，对不同血清型BRV进行了分析。Wang等通过对VP4和VP7基因的序列分析，推测BRV G10血清型是导致新生儿感染的主要致病因素，试验已证实，HRV可以通过基因重组从BRV株中获得基因组片段[24]。同样，在意大利，Sarkar对BRV VP6、VP7、VP4和NSP4基因进行序列分析，研究犬轮状病毒与BRV基因重组片段的关系获得重要线索[25]。总之，BRV的快速进化和新毒株的出现需要对血清型进行密集的监测[26]，加快对新毒株的分析，以尽快解决免疫问题。

8 小结

BRV具有极强的遗传分化特性[27]，对许多常用的消毒方法具有抵抗力，从而增加了预防难度。抗原基因重组或重排是导致疫苗接种程序失败的主要原因。生产中为了减少BRV感染造成的损失，必须加强对饲养及环境卫生的管理。可饲喂给犊牛含BRV特异性抗体的初乳，以减少新生犊牛的感染。若同时感染其他病原体[28]，如大肠杆菌会增强BRV感染的影响，因此必须重视根除此类病原体。此外，利用病毒蛋白亚基阻断BRV的受体也是研究的热点，通过RT-PCR或基因测序分析BRV基因组对于评估该病毒在人类或其他哺乳动物之间的种间传播具有重要意义。在疫苗领域发展新技术的基础上，新一代高效疫苗已成为一种趋势，DNA疫苗和亚单位疫苗已被大量报道。同样，在肠杆菌中表达的重组蛋白也可用于开发疫苗，这种疫苗可以刺激血清和初乳中特异性免疫抗体的产生。还需要重点研究开发植物性可食用疫苗，利用这种廉价疫苗预防BRV具有重要的经济意义，这样更有利于减少人畜共患病的风险[29]。综上，本文针对BRV现阶段研究进行了详细综述，可为将来进一步研究BRV提供参考。