紫红笛鲷血细胞发生研究

钟爱华，牟 毅，高 航，王文鸿

( 浙江海洋大学 水产学院，浙江 舟山 316022 )

鱼类血细胞具有运输、损伤修复、免疫应答等功能，各种血细胞都有一定的寿命，造血器官不断产生新的血细胞以维持外周血细胞数量的相对稳定。白细胞是鱼类免疫系统的重要组成部分，在抵抗病原入侵和疾病免疫方面肩负重要作用，白细胞参数的改变会影响鱼类的免疫功能。硬骨鱼类有多个造血器官，研究发现，头肾、体肾和脾脏是达布里鲟(Acipenserdabryanus)[2]、长鳍裸颊鲷(Lethrinuserythropterus)[3]等鱼类的主要造血器官；军曹鱼(Rachycentroncanadum)中，肝脏也是造血器官[4]。

紫红笛鲷(Lutjanusargentimaculatus)，属硬骨鱼纲、辐鳍亚纲、鲈形目、笛鲷科、笛鲷属，分布于印度洋、南太平洋以及中国南海、台湾海峡等海域，属于热带和亚热带近海近底层鱼类。紫红笛鲷个体较大，体长大者可达600 mm以上，生长较快，肉质鲜美，富含人体所必需的氨基酸和高度不饱和脂肪酸，已成为海水养殖的主要经济鱼类之一。

目前有关紫红笛鲷的研究集中在养殖技术、人工繁殖技术、病害防治以及遗传等方面[5-10]，而对紫红笛鲷血细胞发生以及造血器官的研究很少。笔者通过研究紫红笛鲷血细胞发生以及外周血细胞化学染色，以期为其生理学和免疫学研究积累基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验鱼来自浙江省舟山市，选体色正常、体表无伤、反应敏捷的紫红笛鲷5尾，运回实验室，暂养1 d后进行试验，鱼体质量510～620 g。

1.2 方法

间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐麻醉鱼体后解剖，取出头肾、体肾、肝脏、脾脏，吸水纸吸净每个器官表面血污后，用干净的刀片将每个器官居中作横切、纵切，每个切面在病理级载玻片(世康)上轻轻印5个以上迹面，印片空气中干燥。用含柠檬酸三钠抗凝剂(3.0%)的注射器按1∶4心脏取血，立即涂片，空气中干燥。干燥后的印片和涂片用Wright-Giemsa染液(南京建成)染色10 min，流水缓慢冲洗30 s，晾干，封片，油镜(Olympus显微镜)下观察拍照。对每个器官每张印片随机选取10个视野，分类统计各种不同发育阶段血细胞。每种细胞随机取样20个，测量胞体和胞核长短径，SPSS 17软件统计分析。

各阶段细胞形态标准参照《野生动物血液细胞学图谱》[11]。

2 结 果

2.1 血细胞发生

2.1.1 红细胞系

原红细胞胞体大，圆形或椭圆形，有时有多个伪足。胞质强嗜碱性，染成墨水蓝色或深蓝色，胞浆量少，仅核周围薄薄的一层；核圆形或椭圆形，占细胞绝大部分，核质比大，染色质呈细网状分布，染成紫红色，核仁明显，核周围存在明显的浅色环带区(图1a)。

早幼红细胞比原红细胞小，椭圆形，核质比较大。随着细胞发育分化，胞质嗜碱性减弱，颜色变浅，呈灰蓝色，胞质中出现血红蛋白；细胞核居中或偏位，核内染色质凝集变粗，染成紫红色；核仁模糊。核周有明显的浅色带区(图1b)。

中幼红细胞胞体椭圆形。胞质嗜碱性减弱，呈浅灰色或浅灰蓝色，胞质中血红蛋白增多；细胞核居中或稍偏位，染色质凝集呈粗线状或小块状，染成紫红色，核仁消失(图1c)。

晚幼红细胞胞体卵圆形或椭圆形，胞质中血红蛋白丰富而呈现灰红色或暗红色；细胞核圆形或椭圆形，偶见分叶核，居中或稍偏位，染色质凝集呈粗线状，染成紫红色。核周围有明显的浅色带(图1d)。

红细胞胞体卵圆形或椭圆形，核周浅色带消失；胞质充满血红蛋白，呈灰红色或暗红色；胞核椭圆形或杆状，居中或稍偏位，染色质凝集呈致密粗线状，染成深紫红色或紫黑色；核质比为红细胞系中最小(图1e)。

衰老的红细胞呈椭圆形或不规则形，有时细胞膜边缘不光滑有许多突起，胞体体积缩小，核固缩呈微核状，染色质呈紫黑色，快溶解时核靠近质膜(图1f)。

2.1.2 粒细胞系

原粒细胞胞体圆形或卵圆形，胞浆比原红细胞稍多，嗜碱性比原红细胞稍弱呈蓝色。胞核圆形或椭圆形，居中或偏位，染色质呈细颗粒状，染成紫红色，核仁清晰明显，核质比大(图1g)。

早幼粒细胞胞体圆形或卵圆形；胞质增多，嗜碱性减弱呈浅蓝色，胞质中有少量嗜天青颗粒，染成蓝色。胞核圆形、椭圆形或一侧稍凹陷，偏位，染色质凝集，呈稍粗线状，染成紫红色，核仁模糊，核质比大。从中幼粒细胞开始，胞质中出现特殊颗粒，随着细胞分化成熟，特殊颗粒数量增多(图1h)。

中性中幼粒细胞胞体圆形或椭圆形。胞质比早幼粒细胞多，嗜碱性减弱呈浅灰蓝色或浅灰色，胞质中有嗜天青颗粒和特殊的嗜中性颗粒，嗜中性颗粒分布稀疏染成浅红色。核圆形、椭圆形或有凹陷，偏位，核内染色质呈粗线状，核仁不清。核质比约为1/3～1/2(图1i)。

中性晚幼粒细胞胞体圆形或椭圆形，比中性中幼粒细胞小。胞核圆形或椭圆形，较小，偏位，核内染色质凝集呈粗线状或块状，核仁消失。 胞质丰富，嗜天青颗粒增多，浅红色特殊颗粒增多(图1j)。

中性粒细胞胞体圆形或椭圆形，少量不规则形，是数量最多的一种外周白细胞。胞质无色或极浅的灰色，胞质中含有许多细小的灰蓝色和浅红色颗粒。核多偏位，圆形或椭圆形、少量肾形或棒状，染色质凝集呈粗线状或块状，核质比小(图1k)。

嗜酸性中幼粒细胞胞体椭圆形，胞体较大。细胞质灰红色，内有嗜酸性颗粒, 颗粒大小不一，分布较稀疏，染成暗红色或桔红色。胞核较大，约为细胞的一半，椭圆形或不规则形，多偏位，核内染色质呈紫红色粗线状或块状，核有时被嗜酸性颗粒覆盖致使核膜不清(图1l)。

嗜酸性晚幼粒细胞胞体椭圆形或不规则形，体积较嗜酸性中幼粒细胞小。核椭圆形或不规则形,多偏位，核内染色质浓聚呈粗线状或块状，染成紫红色。胞质暗红色，嗜酸性颗粒增多，颗粒有时覆盖核膜致使细胞核边界不清(图1m)。

嗜酸性粒细胞胞体椭圆形或者不规则形，胞体较小，偶有伪足伸出。胞核形态多样，椭圆形、肾形、棒状、不规则形、分叶，偏位，染色质浓缩致密呈粗线状或粗块状，深紫红色。胞质充满嗜酸性颗粒，连成一片，颗粒有时覆盖核膜，致使细胞核边界不清(图1n，图2)。

嗜碱性中幼粒细胞胞体椭圆形，比早幼粒细胞小。胞质灰蓝色或浅蓝色，胞质中有粗大的嗜碱性颗粒，颗粒大小不一，分布较稀疏。核居中或偏位，圆形或椭圆形，核仁模糊，染色质呈稍粗线状，染成紫红色，核质比大，有时核膜被嗜碱性颗粒覆盖(图1o)。

嗜碱性晚幼粒细胞胞体椭圆形或不规则形，胞体变小。胞质灰色，嗜碱性颗粒分布较密集。胞核圆形、椭圆形、肾形或棒状，多偏位，染色质粗糙呈粗线状或块状，染成深紫红色，核质比小，有时核膜被嗜碱性颗粒覆盖(图1p)。

嗜碱性粒细胞胞体椭圆形或不规则形，外周血细胞中其数量最少。胞质中嗜碱性颗粒密集分布，有时核膜被颗粒覆。胞核椭圆或不规则形，偏位，染色质浓聚呈粗线状或块状，染成深紫红色(图1q)。

图1 紫红笛鲷血细胞发生Fig.1 Blood cells in different developmental stages in red snapper L. argentimaculatus

2.1.3 单核细胞系

原单核细胞胞体椭圆形或不规则形，是最大的原血细胞，胞质比其他原血细胞多，胞质嗜碱性。核椭圆形、肾形或不规则形，偏位，染色质呈细网状，比其他原血细胞分布稀疏，染成紫红色，核仁可见(图1r)。

幼单核细胞胞体细胞长椭圆形或不规则形，偶见伪足。胞质比原单核细胞多，嗜碱性减弱，呈淡蓝色，内有细小的嗜天青颗粒，有时有空泡。胞核长椭圆形或不规则形状，多偏位，染色质比原单核细胞粗糙，呈网状分布，染成紫红色，核质比较原单核细胞小。核仁不清晰(图1s)。

单核细胞呈圆形、椭圆形或不规则形，有时有多个伪足，是外周最大的白细胞。胞质多，呈灰蓝色，内有细小的蓝色嗜天青颗粒，有时有多个空泡。核呈椭圆形、肾形、马蹄形和不规则形，多偏位，染色质粗糙，呈粗网状分布，染成紫红色(图1t)。

2.1.4 淋巴细胞系

原淋巴细胞胞体圆形或椭圆形，偶有伪足伸出，是最小的原血细胞。胞质嗜碱性染成蓝色，胞质少，仅核周围极薄的一层。胞核圆形或椭圆形，占细胞大部分，核质比大，染色质呈网状。核仁清晰可见(图1u)。

幼淋巴细胞胞体细胞圆形或椭圆形，常有伪足。胞质比原淋巴细胞多，嗜碱性减弱呈蓝色或灰蓝色，有时可见嗜天青颗粒。核圆形或椭圆形，多偏位，染色质呈网状，染成深紫红色。核仁模糊(图1v)。

淋巴细胞分大淋巴细胞和小淋巴细胞。

大淋巴细胞胞体椭圆形或不规则形，有时有多个伪足。胞质灰蓝色，量少。胞核圆形、椭圆形或不规则形状，染色质凝集，呈粗网状分布，染成深紫红色(图1w)。

小淋巴细胞胞体小，椭圆形或不规则形。胞质极少，嗜碱性，染成灰蓝色。胞核呈圆形或椭圆形，多偏位，染色质凝集变粗糙，呈粗线或块状分布，染成深紫红色或紫黑色，染色质颜色比大淋巴细胞稍深。偶有嗜天青颗粒(图1x)。

图2 外周血涂片Fig.2 The peripheral blood smears 箭头：嗜酸性粒细胞. Arrowhead: eosinophilic granulocyte.

2.1.5 其他细胞

在头肾印片中发现少量巨噬细胞和浆细胞。巨噬细胞胞体大，有时有多个伪足胞质中有嗜天青颗粒，有时有多个空泡；核较小，多偏位，染色质着色深(图3a)。

浆细胞胞体椭圆形或卵圆形，胞体大，核偏于细胞一侧，核呈椭圆形或不规则形，染色质粗密呈粗线状或块状分布。细胞质嗜碱性，染为蓝色，近细胞核处有一着色较浅的淡染区。胞质中偶有空泡(图3b)。

血栓细胞胞体细长，长椭圆形、纺锤形或泪滴状，是最细长的血细胞。细胞核椭圆形、棒状，占细胞大部分,染成深紫色，居中或稍偏位。胞质呈灰红色或暗紫红色(图3c)。

图3 其他血细胞Fig.3 The other bloool cells a.巨噬细胞； b.浆细胞； c.血栓细胞. a.macrophage； b.plasmocyte； c.thrombocyte.

2.2 血细胞大小及百分比

紫红笛鲷的不同发育阶段血细胞规格见表1，各细胞系在发育过程中细胞逐渐变小，细胞核逐渐变小，染色质凝集变粗。其中单核细胞系较其他各系细胞都大，淋巴细胞系中小淋巴细胞是最小的细胞，血栓细胞是最细长的细胞。

不同发育阶段血细胞百分比见表2。头肾印片中发现各种原始和未成熟的血细胞，体肾中有原红细胞、原粒细胞和原单核细胞，脾脏中发现原淋巴细胞，头肾能分化生成各类型血细胞，体肾能生成红细胞、单核细胞、淋巴细胞和嗜中性粒细胞，脾脏能生成淋巴细胞。肝脏仅发现成熟血细胞。

表1 紫红笛鲷不同发育阶段血细胞规格Tab.1 Cell and nucleus sizes of various hematopoietic cells in red snapper L. argentimaculatrs μm

(续表1)

细胞系Cell lineage细胞类型Cell type细胞规格 Cell size细胞核规格 Nucleus size长径Length短径Width长径Length短径Width粒细胞系Granuloid原粒细胞 Granuloblast14.06±0.1312.83±0.6410.68±0.799.59±0.58早幼粒细胞 Progranulocyte13.07±0.1111.87±0.7110.28±0.528.99±0.52中性中幼粒细胞 Neutrophilic myelocyte12.13±0.2211.47±0.459.69±0.638.27±0.89中性晚幼粒细胞 Neutrophilic metagranulocyte10.91±0.6210.14±0.258.67±0.756.53±0.67中性粒细胞 Neutrophilic granulocyte10.91±0.589.76±0.897.03±0.895.46±0.89嗜酸性中幼粒细胞 Eosinophilic myelocyte10.63±0.5610.26±0.468.01±0.346.23±0.37嗜酸性晚幼粒细胞 Eosinophilic metagranulocyte9.46±0.469.23±0.567.02±0.435.62±0.54嗜酸性粒细胞 Eosinophilic granulocyte8.50±0.438.20±0.545.94±0.344.98±0.54嗜碱性中幼粒细胞 Basophilic myelocyte11.59±0.4610.87±0.619.27±0.718.23±0.69嗜碱性晚幼粒细胞 Basophilic metagranulocyte10.63±0.679.97±0.658.22±0.736.45±0.53嗜碱性粒细胞Basophilic granulocyte9.26±0.238.70±0.757.10±0.525.50±0.35淋巴细胞系Lymphoid原淋巴细胞 Lymphoblast11.56±0.4710.99±0.6310.23±0.628.91±0.57幼淋巴细胞 Prolymphocyte10.36±0.419.79±0.628.97±0.888.31±0.61大淋巴细胞 Big lymphocyte8.29±0.467.76±0.667.34±0.646.93±0.62小淋巴细胞 Small lymphocyte6.84±0.386.49±0.556.37±0.445.89±0.51单核细胞系Monocytoid原单核细胞 Monoblast16.43±0.8113.37±1.1512.23±0.889.73±0.81幼单核细胞 Promonocyte14.94±0.4112.81±0.9910.77±1.089.10±0.77单核细胞 Monocyte13.81±0.7911.72±0.788.54±0.837.21±0.53其他Others血栓细胞Thrombocyte11.32±0.783.58±0.327.01±0.343.53±0.26巨嗜细胞 Macrophage17.56±1.5614.02±1.026.12±0.433.02±0.23浆细胞 Plasmocyte16.31±1.3212.32±0.976.36±0.435.36±0.32

表2 紫红笛鲷4器官中各种血细胞百分比 %Tab.2 The percentages of different blood cells in four organs of red snapper L. argentimaculatus

3 讨 论

3.1 紫红笛鲷血细胞发生规律

血细胞寿命是有限的，在造血诱导微环境的影响和调节下，造血器官中的原始细胞经过一系列形态结构变化，分化生成新生血细胞，不断补充到外周循环系统中，以维持血细胞动态平衡。不同鱼类血细胞发育过程、形态变化并不一致。

紫红笛鲷红细胞发育经历了原红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞和红细胞4个阶段，有些鱼类仅观察到原红细胞、幼红细胞和红细胞3个阶段[12-14]。红细胞发育成熟过程中，胞体逐渐变小，细胞核逐渐变小，染色质由疏松到致密，与草鱼(Ctenopharyngodonidellus)[13]、日本黄姑鱼(Nibeajaponica)[14]等鱼类红细胞发育变化相一致；而另一些鱼类如大弹涂鱼(Boleophthalmuspectinirostris)[15]、长鳍裸颊鲷[3]和斑马鱼(Daniorerio)[16]等，幼稚红细胞比原红细胞和红细胞小。

淋巴细胞和单核细胞发育也表现出多样性。紫红笛鲷淋巴细胞和单核细胞发育过程与其他鱼类相一致，但不同鱼类发育过程中胞体变化不一样。紫红笛鲷原淋巴细胞发育成熟过程中，胞体逐渐变小，与达布里鲟[2]、长鳍裸颊鲷[3]、日本黄姑鱼[14]、斑马鱼[16]等相同；有些鱼类淋巴细胞发育过程中幼淋巴细胞最大，如大弹涂鱼[15]、南方鲇(Silurusmeridionalis)[17]等。紫红笛鲷原单核细胞随着分化成熟，胞体逐渐变小，与达布里鲟[2]单核细胞发育相同；日本黄姑鱼[14]、兴国红鲤(Cyprinuscarpiovar.Xingguonensis)[18]等硬骨鱼类幼单核细胞最大；大弹涂鱼[15]等鱼类幼单核细胞最小。

粒细胞的分化在不同鱼类中存在差异。紫红笛鲷原粒细胞发育至早幼粒细胞后，分化为嗜中性中幼粒细胞、嗜碱性中幼粒细胞和嗜酸性中幼粒细胞，与长鳍裸颊鲷[3]、达布里鲟鱼[2]等鱼类粒细胞发育过程相似；有些鱼类早幼粒细胞仅分化为嗜中性中幼粒细胞和嗜酸性中幼粒细胞，如长吻[16]。

3种粒细胞在发育过程中形态变化也不一样。紫红笛鲷嗜中性粒细胞在成熟过程中，胞体逐渐变小，与达布里鲟[2]、南方鲇[17]等相同；军曹鱼[4]、长鳍裸颊鲷[3]、斑马鱼[16]等鱼类嗜中性粒细胞在发育过程中，胞体先变大后变小；嗜酸性粒细胞在发育过程中胞体逐渐变小，与达布里鲟[2]相似，而长鳍裸颊鲷[3]胞体变化不明显。嗜碱性粒细胞在分化成熟过程中，胞体逐渐变小，与达布里鲟[2]和长鳍裸颊鲷[3]相似。虽然3种粒细胞胞体变化有差异，但是胞质中颗粒均随发育而增多。

鱼类的血栓细胞不同于哺乳动物的血小板，其发育过程不确定，有人认为它们属于白细胞谱系[19]，也有人不同意此观点[20]，鱼类血栓细胞来源还不清楚，紫红笛鲷血栓细胞发育过程不清楚，仅在外周血涂片中观察到成熟血栓细胞。

头肾印片中发现少量巨噬细胞，一般认为哺乳动物中巨噬细胞来源于单核细胞，紫红笛鲷巨噬细胞形态、胞质染色情况与单核细胞很相近，因此推测巨噬细胞也是由单核细胞发育而来。哺乳动物巨噬细胞一般存在结缔组织中，头肾中的观察巨噬细胞有时单个存在，有时成群分布，这与鱼类是变温动物有关，变温动物脾、肾造血组织基质中存在含有色素的巨噬细胞[21]。

头肾印片中还观察到了浆细胞，哺乳动物浆细胞由B淋巴细胞转化而来，紫红笛鲷能观察到两种淋巴细胞，即大淋巴细胞和小淋巴细胞，浆细胞究竟由哪种细胞转化而来，还要做进一步研究。浆细胞一般分布在淋巴结和脾脏中，紫红笛鲷头肾中发现少量浆细胞，表明紫红笛鲷头肾不仅是造血器官还是免疫器官，这与达布里鲟头肾转录组研究结果相似[22]。

3.2 血细胞发育的场所

不同鱼类，具有造血功能的组织器官研究结果不一致。造血器官具有造血诱导微环境，包括造血器官中的基质细胞、基质细胞分泌的细胞外基质和各种造血调节因子组成，造血诱导微环境能诱导原始型血细胞自我更新、增殖、分化，最后形成成熟的血细胞移行到外周循环系统中补充衰老的血细胞。红鳍笛鲷头肾、体肾和脾脏中均发现幼稚型血细胞；肝脏中仅有成熟的血细胞，可能肝脏不具有造血诱导微环境，幼稚血细胞不能在肝脏中分化成熟，肝脏不是造血器官，与达布里鲟[2]、长鳍裸颊鲷[3]和日本黄姑鱼[14]等鱼类相一致；而陈刚等[4]认为军曹鱼肝脏也能生成粒细胞和淋巴细胞。

紫红笛鲷头肾、体肾和脾脏均发现幼稚型血细胞，3种器官都是造血相关器官。