内脂素改善创伤性脑损伤小鼠神经功能修复的研究

吴毅 梁仔 刘墉 刘成辉

创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）的发病主要是由于外力打击造成的脑神经组织损伤，除因直接外力导致的原发性脑损伤外，还可因灶伤后缺血、水肿、血液毒性、免疫炎症等引起继发性脑损伤，大量神经细胞凋亡，严重影响神经功能的恢复[1-3]。有报道指出，我国每年约有数十万人因TBI致死、致残[4]。内脂素是一种脂肪细胞因子，也可称之为烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide phosphoribosyl transferase，NAMPT），是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）补救合成途径中的限速酶，能够调节细胞内NAD+水平从而调控NAD+依赖蛋白的活性[5]。NAD+作为脱氢酶的辅酶，在糖酵解、糖异生、三羧酸循环、氧化呼吸链中具有重要的作用[6,7]。TBI后机体处于高分解代谢应激状态，细胞对能量物质的需要与代谢供给存在失衡，进而引发细胞的凋亡[8,9]。本研究发现，内脂素能够显著降低TBI小鼠病灶周围神经细胞的凋亡，对神经功能的修复有重要的促进作用，有潜在的临床使用价值。现将目前的研究结果进行如下报道，以供学界探讨。

材料与方法

一、实验动物及液压冲击脑损伤模型建立

48只健康成年雄性C57BL/6小鼠（4～6月龄，体质量20～25 g）购自广州赛柏诺生物科技有限公司。小鼠饲养条件：温度20℃～25℃，湿度60%，昼夜光照时间各12 h。小鼠在进行模型制作前，先适应性饲养7 d。液压冲击脑损伤模型采用美国MODEL01-B液压冲击装置，具体方法：小鼠经5%水合氯醛充分麻醉后，头顶部备皮消毒，用眼科剪刀以两耳连线正中位置纵向剪开皮肤，然后剥离皮肤至骨外膜并固定皮肤，然后用龙胆紫在小鼠颅骨矢状缝右侧、冠状缝后侧各4 mm位置做一标记，随后以标记点为中心用磨钻磨一直径8 mm大小的骨窗，用10 mL注射器吸取生理盐水小心冲洗骨窗，去除骨碎片，过程中注意保护硬脑膜完整。骨窗建立后，将液压冲击器的冲击管口小心放置在骨窗内，周围用牙托粉固定冲击管并密闭管口周边缝隙。然后启动液压冲击器，打击强度设定为0.05 MPa，造成气压带动液压打击小鼠脑组织，建立TBI模型。随后，双抗工作液（青霉素：100 U/mL，链霉素：0.1 mg/mL）冲洗伤口，骨蜡封闭骨窗，缝合伤口皮肤，消毒皮肤。

二、分组与治疗

通过液压打击法建立的48只TBI小鼠模型，随机分为实验组A、实验组B、对照组，每组16只[10]。模型建立3 h后，实验组A和实验组B均给予内脂素（货号：68373，Sigma公司，美国）治疗，剂量分别为15、30μg/kg，腹腔注射，1次/d，治疗7 d。对照组仅给予腹腔注射生理盐水。

三、小鼠神经功能缺损评分

模型建立后，在治疗开始前、治疗开始后第3、14、28天分别进行小鼠神经功能缺损评分（neurological severity scores，NSS），具体评分项目包括：出圈、偏瘫、直线行走、惊吓反射、探究行为、方杆平衡（5 mm）、圆杆平衡（5 mm）、方杆行走（3 cm）、方杆行走（2 cm）、方杆行走（1 cm）。上述任务完成计0分，失败计1分，评分越高，神经功能损伤越重[11]。

四、Morris水迷宫实验

治疗结束后第24～28天，通过Morris水迷宫试验观察小鼠治疗后学习记忆功能的恢复情况。水迷宫装置包括轨迹跟踪摄像机、计算机系统、圆形水池（d：1.2 m；h：0.6 m）。具体方法：在圆形水池中注水至深度0.5 m，然后加入足量牛奶至液体奶白色。圆形水池第Ⅰ象限页面下2 cm深度未平台所在位置。将小鼠分别从水池Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限放入水池中，开始计时，观察小鼠在90 s内是否找到平台，若不能则帮助其找到平台以让小鼠获知平台位置。记录小鼠从不同象限放入后找到平台的时间，即逃逸潜伏期时间。

五、小鼠全脑组织的获取及石蜡切片

治疗结束后第2天，每组随机取3只小鼠全脑取材，用于TUNEL染色。具体方法：小鼠经5%水合氯醛充分麻醉后，眼科剪剪开小鼠颅盖骨后部，止血钳剥离颅骨，显微剪剪断颅底神经获取全脑样本，放入福尔马林中固定标本，24 h后进行脱水、透明，然后石蜡包埋组织，以5μm厚度进行石蜡切片。

六、TUNEL染色

一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（北京碧云天科技有限公司）用于细胞凋亡的检测。染色步骤：（1）切片在二甲苯中脱蜡2次，每次10 min；（2）依次无水乙醇浸泡5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸馏水2 min；（3）滴加20μg/mL不含DNase的蛋白酶K，室温作用30 min，然后PBS洗涤3次，每次5 min；（4）滴加TUNEL检测液覆盖组织，37℃避光孵育60 min；（5）PBS洗涤3次，每次5 min；（6）用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。阳性细胞数的计数方法：在400倍视野下，以着力点为中心周边任意6个视野中的阳性细胞数取平均数，共计数6张切片。

七、Western blot检测

治疗结束后第2天，每组随机选取3只小鼠取脑组织蛋白。小鼠经充分麻醉后，用0.9%生理盐水充分灌注，然后获取着力点位置（骨窗下）黄豆大小脑组织，匀浆机处理后，用RIPA裂解液（北京碧云天科技有限公司）冰上裂解30 min，随后在4℃12 000 r/min，有效半径10 cm，离心10 min，吸取上清液获取总蛋白。BCA蛋白浓度检测试剂盒（北京碧云天科技有限公司）测定蛋白浓度。以每个样品40μg总蛋白上样量加到SDS-PAGE胶孔中，以80 V恒压电泳，至蛋白marker跑至凝胶下缘时停止。切取 蛋 白cleave Caspase-3、Caspase-3、PRAP、GAPDH相应分子量条带进行PVDF膜转膜处理，以280 mA转膜70 min。取出条带放入5%BSA溶液中室温封闭处理1 h，然后用塑封杂交袋进行一抗孵育（一抗均用5%BSA溶液按照1∶1000稀释使用）。4℃冰箱中孵育过夜后，TBST溶液洗涤一抗3次，5 min/次，然后进行相应种属二抗孵育（二抗用TBST溶液按照1∶10 000稀释使用），室温孵育1 h。然后洗涤二抗3次，每次5 min。条带用ECL显影液显影后曝光。

八、统计学分析

采用SPSS20.0软件进行统计学分析，NSS评分、潜伏逃逸时间等计量资料以均数±标准差（）表示，2组间比较采用两独立样本t检验，3组间均数比较采用F检验，检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、3组脑损伤小鼠NSS评分比较

实验干预前，3组小鼠的NSS评分比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。开始治疗后第3天，3组小鼠的NSS评分差异无统计学意义（P＞0.05）；而在第14、28天时，3组小鼠的NSS评分差异均具有统计学意义（P＜0.05），且实验组B优于实验组A。详细信息见表1。

表1 3组小鼠的神经功能缺损评分比较（）

表1 3组小鼠的神经功能缺损评分比较（）

与对照组比较，a P＜0.05

二、3组小鼠水迷宫潜伏逃逸期时间比较

3组小鼠24、25 d时潜伏逃逸期差异无统计学意义（P＞0.05），在26、27、28 d时潜伏逃逸期差异有统计学意义（P＜0.05），实验组潜伏逃逸期时间较对照组更短，小鼠能够更快地找到平台，且内脂素剂量更高，潜伏逃逸期越短（表2）。3组小鼠第28天时水迷宫路径图见图1。

表2 3组小鼠水迷宫潜伏逃逸期比较（s，）

表2 3组小鼠水迷宫潜伏逃逸期比较（s，）

与对照组比较，a P＜0.05；与实验组A比较，b P＜0.05

三、3组小鼠细胞的凋亡检测结果比较

TUNEL染色结果显示，内脂素治疗后组织切片中阳性细胞数明显减少，实验组A、实验组B与对照组比较，差异均具有统计学意义（t=2.533、P=0.030，t=3.946、P=0.003）（图2A～B）。Western blot检测显示，内脂素降低了小鼠脑损伤后神经细胞凋亡相关蛋白cleave Caspase-3、cleaved PARP的表达量，实验组A、实验组B与对照组比较，差异均具有统计学意义（t=6.023、P=0.026，t=5.838、P=0.028）（图2C～D）。

讨 论

脑组织是人体各系统中代谢最为旺盛的组织，需要大量的能量供给以维持正常的细胞代谢、电生理活动[12]。TBI发生后早期，脑组织常处于代谢应激状态，对物质和能量的需求剧增，脑损伤可导致局部血循环障碍、局部出血、水肿等，引起的二次损伤进一步加剧了氧供需失衡，神经细胞在原发性和继发性因素作用下逐渐凋亡[13,14]。研究证明，细胞内NAD+水平对哺乳动物细胞的存活非常重要，细胞中NAD+含量不足能够引起细胞的凋亡，其中一个重要机制是NAD+水平能够显著影响Caspase依赖性核酸内切酶DFF40的活性，从而造成DNA断裂，促发凋亡[15,16]。内脂素是NAD+补救合成途径中的限速酶，对NAD+有重要的作用[17]。有研究表明，激活内脂素，促进NAD+的合成能够增强啮齿类动物的学习和记忆能力，可抑制神经细胞凋亡[18,19]。TBI后神经细胞处于处于高分解代谢应激状态，细胞对能量物质的需要与代谢供给存在失衡，进而引发细胞的凋亡，因此提高细胞的代谢能力有助于神经细胞度过代谢应激导致的供能不足[8,9]。

图1 3组小鼠第28天时水迷宫路径图

图2 3组小鼠TUNEL染色及凋亡相关蛋白比较

本研究通过液压打击方式建立了小鼠TBI模型，该模型较好地模拟了临床TBI病情，是国际上通用的动物TBI模型。通过内脂素的干预，从神经功能修复、学习记忆能力两方面评价内脂素的治疗作用。研究结果发现，内脂素的干预对TBI后小鼠NSS评分有明显的影响。开始治疗前，3组小鼠间NSS评分无明显差异，具有良好的可比性，自开始治疗后第3天，3组间小鼠NSS评分无明显差异，考虑此刻处于水肿高峰期刚过，神经功能恢复尚未出现明显改善，而在治疗后第14、28天，小鼠的NSS评分显著低于对照组，并且高剂量内脂素组小鼠NSS评分要低于低内脂素剂量组小鼠，即神经功能修复情况更好。由此可见，内脂素对TBI小鼠的神经系统支配的运动功能修复有明显的改善作用。本研究还通过水迷宫实验评价了内脂素对TBI后小鼠学习记忆能力修复的作用，水迷宫功能实验在早期对小鼠进行学习记忆能力训练，让小鼠熟悉水迷宫环境下平台位置，通过比较小鼠对平台位置记忆及寻找平台所需要的时间来评价小鼠的学习记忆能力。与神经支配运动功能修复情况的趋势一致，内脂素对TBI后小鼠的学习记忆能力修复同样有明显的改善作用，内脂素治疗后的小鼠能够更快速记住水面下平台位置，迅速找到平台。神经系统支配的运动功能、学习记忆能力都是在相关功能神经元细胞的调控下完成的，这类神经细胞属于高度分化的不可再生细胞，在脑创伤中，除原发性脑损伤可以导致神经细胞的直接死亡，继发性脑水肿等二次损伤因素则进一步加剧了神经细胞的死亡及神经功能的恶化[20,21]。本文通过TUNEL实验和凋亡相关蛋白表达水平检测分析了细胞凋亡差异是否与不同组内小鼠脑细胞凋亡差异有关。结果发现，内脂素治疗后TUNEL阳性细胞数目明显更少，说明内脂素降低了小鼠TBI后神经细胞凋亡，并且凋亡相关蛋白cleave Caspase-3、cleaved PARP的表达量也明显降低。

综上所述，内脂素通过其促进细胞内NAD+及其代谢产物的合成功能，一定程度上缓解了TBI后代谢应激带来了压力，对能量供需平衡起到了调节作用，从而抑制TBI后神经细胞的凋亡，对神经细胞起到了保护作用，促进了神经功能的修复。