SPE-UPLC法测定养血清脑水提浸膏中的毛蕊花糖苷和细辛脂素的含量

徐 波，牛 涛，陈 红，张学敏

(天津天士力现代中药资源有限公司，天津 300410)

养血清脑颗粒是天士力医药集团研制、生产的复方中药制剂，具有养血平肝、活血通络等功效，可用于血虚肝亢所致的头痛、眩晕眼花、心烦易怒、失眠多梦等病症。药理研究表明养血清脑颗粒具有改善软脑膜微循环、增加脑血流量、缓解血管痉挛和止痛等作用[1]。养血清脑水提浸膏是为养血清脑颗粒和养血清脑丸的制剂中间体，制备工艺为：熟地、夏枯草、细辛等六味药材加水煎煮2次，提取液滤过，浓缩至一定浓度，加乙醇适量，静置12～24 h，滤过，回收乙醇，浓缩至适量，即得[2]。

目前，养血清脑颗粒的质量控制主要针对制剂中的芍药苷和多种酚酸类成分进行定量测定，还缺乏制剂中间体和其他药味成分的质量评估方法。本试验测定的毛蕊花糖苷和细辛脂素分别源于养血清脑水提浸膏处方中的熟地和细辛药材[3，4]，毛蕊花糖苷具有抗炎、抗氧化作用[5，6]，细辛脂素具有体外免疫抑制作用[7，8]，这些作用与养血清脑颗粒养血平肝、活血通络的功效相契合。本研究通过建立毛蕊花糖苷和细辛脂素的含量测定方法，有助于更全面地评价制剂质量水平，为其质量标准提升和药效研究提供参考依据。

1 仪器与试药

仪器： Waters Acquity超高效液相色谱仪，TUV紫外检测器，Empower3化学工作站(美国Waters公司)；XS105-UV电子天平(瑞士 METTLER公司)；Milli-Q超纯水处理系统(美国 MILLIPORE公司)。

试药与耗材： 毛蕊花糖苷(中国食品药品检定研究院，111530-201603)；细辛脂素(中国食品药品检定研究院，111889-201502)；养血清脑水提浸膏(天津天士力现代中药资源有限公司)；ProElut C18-U(500mg，6mL)固相萃取柱(迪马科技有限公司)。

2 溶液的制备

2.1 对照品溶液

精密称取毛蕊花糖苷和细辛脂素对照品适量，加甲醇配制成每毫升含毛蕊花糖苷和细辛脂素分别为0.004 mg和0.01 mg的溶液，即得。

2.2 供试品溶液

精密称取养血清脑水提浸膏约0.25 g，加25%甲醇溶液约10 mL，超声溶解，摇匀，置于已处理好的ProElut C18-U固相萃取柱。用25%甲醇溶液5 mL洗涤，弃去。用40%甲醇溶液4.5 mL洗脱，收集洗脱液至5 mL容量瓶中，加40%甲醇溶液至刻度，摇匀，得供试品溶液1。继续用60%甲醇溶液5mL洗涤，弃去。用甲醇4.5 mL洗脱，收集洗脱液至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得供试品溶液2。

3 色谱条件

3.1 毛蕊花糖苷测定

使用UPLC色谱系统，采用Acquity UPLC HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm，2.1 mm×100 mm)，以0.2%甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B。流速为0.4 mL·min-1，检测波长为334 nm；取供试品溶液1进样，进样量为2 μL。梯度洗脱条件，见表1。色谱见图1。

表1 流动相梯度洗脱条件

图1毛蕊花糖苷标准品图谱(a)和样品图谱(b)

3.2 细辛脂素测定

使用UPLC色谱系统，采用ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色谱柱，以水为流动相A，以乙腈为流动相B。流速为0.4 mL·min-1，检测波长为287 nm；取供试品溶液2进样，进样量为2 μL。梯度洗脱条件，见表2。色谱见图2。

表2 流动相梯度洗脱条件

4 方法与结果

4.1 线性关系考察

精密称取毛蕊花糖苷和细辛脂素对照品适量，加甲醇分别配制成每毫升含毛蕊花糖苷和细辛脂素的混合对照品溶液，再分别量取0.1、0.2、0.4、0.8、1 mL混合对照溶液置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，混匀，制成系列溶液，按前述标题“3”项下色谱条件进样，以浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标进行回归，求得回归方程。毛蕊花糖苷的回归方程为：A=6 159.14C+877.64(r=0.999 9)，表明毛蕊花糖苷在1.58～15.8 μg/mL浓度范围内，峰面积和浓度线性关系良好。细辛脂素的回归方程为：A=6 702.03C+1 794.94(r=0.999 8)，表明细辛脂素在2.12～21.2 μg/mL浓度范围内，峰面积和浓度线性关系良好。

图2细辛脂素标准品图谱(a)和样品图谱(b)

4.2 进样精密度试验

分别量取毛蕊花糖苷和细辛脂素供试品溶液，按前述标题“3”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积，毛蕊花糖苷和细辛脂素峰面积的RSD分别为0.8%和0.5%，结果表明进样精密度良好。

4.3 重复性试验

精密称取养血清脑水提浸膏6份，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“3”项下色谱条件进样测定，毛蕊花糖苷和细辛脂素的平均含量分别为0.074 0 mg/g和0.065 5 mg/g，RSD分别为1.9%和1.8%，结果表明所用方法的重复性良好。

4.4 加样回收率

精密称取养血清脑水提浸膏6份样品，每份约0.125 g，各分别精密加入对照品溶液2 mL(每毫升含毛蕊花糖苷和细辛脂素分别为0.003 55 mg和0.004 23 mg)，自“加25%甲醇溶液适量，超声溶解”起，照含量测定项下依法处理，作为供试品溶液，取2 μL注入色谱仪，计算回收率，结果见表3。

表3 回收率实验结果 (%，n=6)

4.5 稳定性试验

量取供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、18 h进样，记录毛蕊花糖苷和细辛脂素的峰面积，峰面积的RSD分别为1.0%和0.9%，表明供试品溶液在18 h内稳定性良好。

4.6 样品测定

称取不同批次的养血清脑水提浸膏，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“3”项下色谱条件进样测定，以外标法计算含量，结果见表4。

表4 样品测定结果 (mg/g)

4 讨论

4.1 SPE纯化方法的优化

养血清脑水提浸膏处方由6味中药组成，成分非常复杂，且待测成分含量均较低，必须对样品进行纯化富集，提高信噪比，满足分析要求。本实验采用固相萃取方法，通过对待测成分保留特性的考察，对除杂溶媒强度和用量等参数进行优化，实现了采用最简单的固相萃取梯度洗脱条件，通过一支固相萃取柱实现了两个成分的分离纯化和富集。

我们首先考查固相萃取柱对待测成分的保留特性，分别以不同洗脱强度的溶媒对待测成分标准品进行上样和洗脱，确定ProElut C18-U固相萃取柱对毛蕊花糖苷和细辛脂素的泄漏溶媒强度分别为30%和70%甲醇溶液。通过对除杂溶媒强度的考察，分别确定了以25%甲醇溶液5 mL对毛蕊花糖苷待测样品进行除杂，以60%甲醇溶液对细辛脂素待测样品进行除杂，收到了最好的除杂效果。同时，以25%甲醇溶液最为上样液也降低了样品中高极性杂质的溶解度，降低了固相萃取柱负担。

4.2 色谱条件优化

本实验采用超高效液相色谱进行测定，并对流动相和梯度洗脱条件进行了简单优化，最终提高了检测效率，获得了最佳分离效果，从而使毛蕊花糖苷和细辛脂素的含量测定结果更为准确。