绵羊EYA3 基因表达及其多态性与季节性发情之间的关系

夏 青 ，王翔宇，胡文萍，马 琳，张效生，张金龙，狄 冉*，储明星*

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193；2.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381）

世界上绝大多数绵羊为季节性发情品种，仅有少数品种为常年发情[1-2]。季节性发情是限制绵羊生产效率的重要因素之一，因此，找到参与季节性发情调控机制的关键基因，研究其参与季节性发情的分子机制并应用于育种实践，是提高绵羊繁殖力的有效方法之一。季节性发情基因-眼缺失基因（Eyes Absent，EYA）可编码一类眼缺失家族蛋白，EYA 家族蛋白具有磷酸酶活性，对于视网膜的发育具有重要调控作用[3-5]，其中EYA3作为昼夜节律基因对绵羊季节性发情具有间接调控作用[6-8]。本实验室前期选取了常年发情组（湖羊、小尾寒羊和策勒黑羊）和季节性发情组（滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊）共6 个品种[9-10]，对这6 个绵羊品种进行全基因组重测序，发现EYA3基因编码区上游调控区存在突变位点g.238191128G＞C。

本研究选择常年发情的小尾寒羊和季节性发情的苏尼特羊，检测在发情相关组织中EYA3基因的表达特征并分析2 个不同品种之间的表达差异。利用Sequenom Mass ARRAY®SNP 技术对EYA3基因g.238191128G＞C位点在2 组不同品种绵羊中分型，分析该位点的多态性，并与季节性发情性状进行关联，以揭示EYA3基因g.238191128G＞C 位点与绵羊季节性发情的关系。

1 材料与方法

1.1 基因表达实验样品采集 实验羊来自天津市畜牧兽医研究所畜禽繁育基地人工控光条件下饲养的2～3 周岁的健康卵巢切除（Ovariectomised,OVX）母羊。人工控光模型为两品种母羊在短光照（白天8 h，黑夜16 h）（人工模拟发情季节）下，饲养42 d 后，转至长光照（白天16 h，黑夜8 h）（人工模拟非休情季节）饲养49 d，并根据文献报道[7,11-12]选择在长光照条件下49 d 的小尾寒羊（Small Tail Han sheep，STH）母羊和苏尼特羊（Sunite sheep，SNT）母羊各3 只。屠宰后，迅速采集垂体、下丘脑和大脑共3种新鲜组织样品，装入2 mL冻存管，并储存在-80℃冰箱中备用。

1.2 引物设计 根据NCBI 数据库中绵羊EYA3基因序列（GenBank 登录号：XM_004002368），用Primer 3软件设计1 对荧光定量引物，内参基因选用β-actin，引物信息见表1。

1.3 组织RNA 提取和cDNA 合成 利用动物组织总RNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）采用Trizol（Invitrogen，美国）法提取各组织总RNA，并用Nanodrop 2000 检测提取的RNA 浓度和OD 值，用1.0% 的琼脂糖凝胶电泳检测RNA 完整性。使用PrimerScriptTMRT Reagent Kit 反转录试剂盒合成cDNA第一链，按照说明书进行操作。反转录产物稀释后，用内参基因β-actin进行PCR 检测，检测合格后，-20℃保存。

1.4 实时荧光定量PCR（qPCR） 根据课题组前期设置的qPCR 体系和程序[13-14]，其中qPCR 体系总体积为20 μL：SYBR®Premix ExTaqTMⅡ 10 μL，RNase-Free ddH2O 6.4 μL，上、下 游 引 物(10 nmol/L) 各0.8 μL，cDNA 2 μL。反应条件：95℃预变性5 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s，40 个循环。建立和绘制目的基因及持家基因的标准曲线，检测引物扩增效率和熔解曲线状态，并进行qPCR 反应以检测目的基因的相对表达量。

1.5 基因分型 对EYA3基因g.238191128G＞C 位点在不同发情性状的绵羊品种中进行分型，采用Sequenom MassARRAY®SNP 技术对该位点进行基因型检测。分型样品选择：小尾寒羊407 只、湖羊101 只、策勒黑羊52 只、滩羊22 只、苏尼特羊21 只和草原型藏羊161 只，其中小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊为常年发情品种，其他为季节性发情品种。分型样品为DNA，每个样品需要量为20 μL，DNA 浓度为40～80 ng/μL。

1.6 统计分析 根据2-ΔΔCt法[13,15]计算目的基因相对表达量；借助Excel 计算EYA3基因g.238191128G＞C 位点的基因型频率、等位基因频率、多态信息含量（PIC）、杂合度（He）及有效等位基因数（Ne），并进行Hardy-Weinberg 检测。利用SPSS 19.0 软件中卡方独立性检验进行常年发情组和季节性发情组间基因频率与基因型频率差异显著性检验，所得数据用平均值±标准误表示。

2 结果

2.1EYA3基因在不同特征绵羊品种季节性发情相关组织中的表达 如图1 所示。EYA3基因在小尾寒羊和苏尼特羊大脑、下丘脑和垂体3 种组织中均有表达，其中苏尼特羊EYA3基因在垂体中表达量极显著高于大脑；且长光照条件下苏尼特羊垂体组织EYA3表达量显著高于小尾寒羊垂体组织，而大脑和下丘脑EYA3表达量在小尾寒羊和苏尼特羊之间均无显著差异。

2.2EYA3基因的多态性分析 通过基因分型发现EYA3基因g.238191128G＞C 位点在常年发情和季节性发情绵羊品种中均存在3 种基因型，分别是GG、GC 和CC（图2）。

表1 引物信息

由表2 可知，绵羊EYA3基因g.238191128G＞C 位点基因型频率和等位基因频率在常年发情和季节性发情绵羊品种间差异均达到极显著水平，且无论在常年发情还是季节性发情品种中C 均是优势等位基因。

如表3 所示。绵羊EYA3基因g.238191128G＞C 位点在小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊、滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊中表现为低度多态（PIC＜0.25）。卡方适合性检验结果表明，该位点在小尾寒羊、策勒黑羊、滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊5 个群体中均处于哈代温伯格平衡状态（P＞0.05）。

3 讨 论

3.1EYA3基因表达与绵羊发情之间的关系 有研究报道，EYA3基因在绵羊多种组织中广泛表达，且长光照表达量高于短光照[14,16]；EYA3基因在大鼠下丘脑中有表达[17]；EYA3基因在人类骨髓、胚胎、肝、肌肉、大脑和肠中均有表达[18]。本研究发现无论在小尾寒羊还是苏尼特羊中，EYA3基因在3 种组织中均广泛表达，与上述相关文献报道相一致。本实验中，EYA3基因在苏尼特羊垂体的表达量高于大脑和下丘脑，结合相关报道[11,19-20]，推测EYA3基因可能主要在苏尼特羊垂体部位发挥作用，而垂体直接参与下丘脑-垂体-性腺轴（Hypothalamic-pituitary-gonadal Axis，HPGA）的 生理调控过程。在长光照条件下，外界光照刺激绵羊松果体分泌褪黑素，褪黑素与褪黑素受体结合促使季节性发情的苏尼特羊垂体结节部的EYA3基因表达量上升[12,21]，高浓度EYA3上调TSHβ的表达量，最终导致T3 浓度升高，苏尼特羊进入休情状态[22]。由于本实验采取的是在长光照下饲养的苏尼特羊和小尾寒羊组织，即长光照下苏尼特羊垂体EYA3表达量显著高于小尾寒羊，苏尼特羊中高浓度的EYA3 间接促使苏尼特羊进入休情状态，而小尾寒羊中EYA3 浓度较低，在长光照下依旧可维持发情状态。

3.2EYA3基因多态性及其与绵羊发情之间的关系 目前，关于绵羊EYA3基因的多态性及其与绵羊季节性发情之间关系的研究鲜有报道。本实验结果表明，绵羊EYA3基因g.238191128G＞C 位点在小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊、滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊中表现为低度多态（PIC＜0.25），说明其多态性较低，选择潜力不大。卡方适合性检验结果表明，该位点在小尾寒羊、策勒黑羊、滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊5 个群体中均处于哈代温伯格平衡状态，说明种群未受到人工或自然选择、迁移和遗传漂变的影响。该位点基因型频率和等位基因频率在常年发情和季节性发情绵羊品种间差异均达到极显著水平，推测该位点突变在一定程度上与季节性发情有关。

表2 EYA3 基因g.238191128G＞C 位点在常年发情和季节性发情绵羊品种中的基因型频率和等位基因频率

表3 EYA3 基因g.238191128G＞C 位点在不同绵羊品种中的群体遗传学分析

4 结 论

本实验初步提示EYA3基因表达可能与绵羊季节性发情有关，该基因的高表达能促使苏尼特羊进入休情状态，g.238191128G＞C 位点与绵羊季节性发情性状存在显著相关，推测该基因是绵羊季节性发情调控基因之一。