龙爪果提取物的热裂解产物分析及其应用

侯亚龙， 钱 蕾， 毛璐伊， 夏永军， 罗昌荣

（1. 上海牡丹香精香料有限公司，上海 201210；2. 上海理工大学 医疗器械与食品学院，上海 200093）

在烟草工业中，卷烟加香加料会用到各种果实类提取物[1-3]，这些提取物既可以丰富和增浓烟气，又可以降低烟气的刺激性和干燥感，使烟气柔和细腻，掩盖杂气，对卷烟产品品质的提升起到重要作用。

龙爪果，又名拐枣、枳椇，是落叶乔木枳椇果实中膨大的肉质果梗，因其多分支且弯曲形似龙爪而得名。龙爪果甘甜无异味，在我国分布广泛，陕西、湖北、广东、浙江、江苏等省主产，安全可食，果香浓郁，营养成分丰富[4-5]，也含有丰富的多酚、黄酮、多糖等功能性成分，具有抗炎、减脂、解酒保肝、抗氧化等[6-9]功效。目前，国内对龙爪果梗的应用主要集中在将其作为食品原料，用于加工果汁、果醋、果酒等功能型饮品和营养保健品[4,10-15]，在烟草方面的应用未见报道。

龙爪果本身具有果甜香、草本香，与烟草风味协调，其还原糖（葡萄糖和果糖）、氨基酸、蛋白质、有机酸（苹果酸、柠檬酸、富马酸等）、维生素（维生素C、维生素B1、维生素B2、胡萝卜素）含量均较高[5]。这些成分在烟支燃吸过程中可形成大量风味化合物，对提升烟草抽吸品质有重要作用，因此具有作为烟草添加剂使用的基础。

溶剂提取法是烟用香料提取的常用方法，该法简单、易于工业化，过程控制容易，因此采用溶剂提取法来获得龙爪果中可烟用的有效成分。

烟用香料的分析不同于普通的香精香料，其加入烟支后，需经过高温燃烧通过烟气进入人体的感觉器官使消费者感知到，因此需通过模拟烟支燃烧条件，使龙爪果提取物高温裂解，形成的裂解产物通过捕集装置进行富集后，再通过一定方式释放进入气相色谱-质谱联用仪进行分析[16-17]。通过鉴定出来的化合物来了解龙爪果梗提取物可能对烟气产生的影响，以便确定其在烟草产品中的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料与试剂：龙爪果梗，产自陕西旬阳；乙醇95%，上海冠鸿化工有限公司；无水乙醇（优级纯）；玻璃棉（农残级）；石英棉（农残级）；

1.2 仪器与设备

RCT 合成套装（3L 加热套），德国IKA 公司；SL2000M 型顶置式搅拌器，德国Julabo 公司；飞鸽牌LXJ-Ⅱ型离心机，上海安亭科学仪器厂；R-215 旋转蒸发仪，瑞士Buchi 公司；多功能反应釜，德国Julabo 公司；CDS5250T 裂解仪，CDS Analytical Inc.；7890A-5975C 气相色谱-质谱仪，美国安捷伦科技公司；色谱柱：HP-5（30 m×0.25 mm×0.25 µm），美国安捷伦科技公司；分析天平XPE205，梅特勒-托利多公司；电子天平PL6001E/02，梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 龙爪果梗提取液的制备

自然干燥的龙爪果梗，挑选饱满无虫蛀霉变的部分，称取200 g，装入3 000 mL 三口瓶中；按液固比7∶1，加入一定体积分数的乙醇使龙爪果梗充分润湿；乙醇体积分数分别为0，15%，30%，50%，70%；安装好温度计、机械搅拌装置和5 ℃回流冷凝装置，转速60 r/min 搅拌，加热至沸后保持恒沸并计时，提取2 h 后停止加热；经250 μm孔径筛网过滤除去果梗，滤液迅速冷却至室温，经离心机2 000 r/min 离心10 min，取上清液，得到不同体积分数乙醇提取的提取液。将这些提取液经旋蒸浓缩至相对密度为1.250±0.008，4 ℃冰箱保存，待用。

1.3.2 卷烟加料与感官评吸

1.3.2.1 卷烟加料

以烟丝重量的0.1%计算龙爪果提取浓缩液的添加量，按需取一定量样品于10 mL 容量瓶中，用70%（体积分数）乙醇定容，摇匀备用。

取未加香加料的空白烟支，分为样品组和空白对照组；样品组按照龙爪果提取时的乙醇浓度分别进行编号，取该编号所对应的龙爪果提取物稀释液，用10 µL 注射器吸取5 µL 稀释液，缓慢均匀地注入到整支烟中。空白对照组用同样方法注入70%乙醇。

完成后将所有烟支放到恒温[（22±1）℃]恒湿（相对湿度为60%±2%）箱中平衡48 h，待评吸。

1.3.2.2 感官评吸

采用拉丁方阵设计[18]确定每一个评吸员对已编号烟支的评吸顺序，以有效避免评吸过程中会出现的“位置效应”、“尾随效应”、“评吸员效应”。

评吸结果采用暗评计分法，由6 名身体健康、经验丰富的优选评吸员，在通风良好的专用评吸室内互不干扰进行抽吸评价。每位评吸员将样品烟与空白烟对比抽吸，按照评吸要求对各项指标进行计分。3 分表示样品烟的感官指标与空白烟一致，高于3 分表示样品烟的感官指标优于空白烟，低于3 分则表示样品烟的感官指标劣于空白烟，最高分为5 分，最低分为1 分，以此给出样品烟的评价分数。

1.3.3 裂解气相色谱-质谱联用分析龙爪果提取液

1.3.3.1 试样装填

取裂解管，装填1～2 mg 石英棉，在900 ℃下烘30 min 后，冷却备用。使用5 µL 锥体头进样针取龙爪果70%醇提液2 μL 置于裂解管中的石英棉上，然后将裂解管放入裂解仪上待裂解。

1.3.3.2 裂解条件

裂解气为氧氮混合气（氧气和氮气按体积比9∶91 混合），气体流量：70 mL/min；裂解仪阀箱温度：280 ℃；裂解仪传输线温度：280 ℃；冷阱捕集温度：−60 ℃；冷阱系统：在去活不锈钢管中间位置从两端装填约2 mg 玻璃棉；气体流量计：量程0～1 000 mL/min，精确度±3%；裂解升温程序：初始温度300 ℃，保持5 s，以30 ℃/s 升至900 ℃，保持5 s。

裂解形成的产物经氮气吹扫进入冷阱，冷阱温度在5 min 内由−60 ℃升至280 ℃，进行脱附，同时进样至气相色谱，经色谱柱分离后进入质谱检测。

每个样品平行测试两次；每测试一个样品做一次空白。

1.3.3.3 色谱条件

色谱柱 HP-5MS（30 m × 250 μm × 0.25 μm）；进样口温度250 ℃，传输线温度：280 ℃；载气：高纯氦气（99.999%）；分流模式，分流比10∶1；柱流速1 mL/min；升温程序：40 ℃保持3 min，然后 10 ℃/min 到240 ℃，然后20 ℃/min 到280 ℃保持5 min。

1.3.3.4 MS 采集参数

电子轰击（EI）离子源；电离能量：70 eV；接口温度：280 ℃；全扫描质量数范围：29～450；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃。

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1.3.3.5 定性及半定量方法

采用质谱谱库NIST11，Wiley275 进行检索定性，匹配度大于70%的化合物保留；峰面积归一化法进行裂解产物的半定量分析。峰面积归一化百分含量按下式进行计算：

式中：Xi为某热裂解产物的峰面积归一化百分含量；Mi为某热裂解产物的峰面积；为全部热裂解产物总峰面积。

1.3.4 Maillard 反应

龙爪果70%醇提浓缩物100 g，复配氨基酸41 g，葡萄糖59 g，去离子水100 mL，放入反应釜中，安装回流冷凝装置，机械搅拌100 r/min，加热至反应液内部温度100 ℃，保持2 h。反应结束，迅速冷却，产物4 ℃保存，待评吸。

2 结果与分析

2.1 不同体积分数乙醇提取的龙爪果提取物感官评价

按照方法1.3.2.1 将不同体积分数乙醇提取得到的提取浓缩物添加至烟支中，依据1.3.2.2 方法进行评吸，结果见表1。

从表1 可以看出70%醇提物的抽吸效果最佳，可提升香气质和香气量，使烟气浓度提高并且更细腻柔和，降低烟气刺激性和干燥感，改善余味。乙醇体积分数低于50%时，所得提取物在加料抽吸时表现为刺激性较大、干燥感较明显，这两项的得分较低。这主要是因为蛋白质、果胶、淀粉等分子量大的物质随着乙醇体积分数的提高溶解度大幅下降，因此70%醇提取物中这类大分子物质含量极低。蛋白质在高温燃吸时会形成羽毛烧焦的臭味并且会产生苦涩辛辣的感觉，果胶热解则产生甲醇，对烟气吸味不利[19-20]。因此，蛋白质、果胶等的减少可以降低烟气的刺激性、余味改善。而70%乙醇并未显著影响糖、氨基酸、小肽、维生素、小分子有机酸等对烟气有贡献成分的溶出，且可以增加萜烯类、烷醇类、杂环类、有机酸类等风味化合物的溶出，有助于提升烟气的香气质和香气量。醇提也可使多酚和黄酮类物质的溶出增大，这些物质可以起到抗氧化、清除自由基等作用，降低烟气的危害性。如果采用更高体积分数乙醇提取的话，则会显著影响糖、氨基酸等物质的溶出，使得提取液中的有效烟用成分大大降低，因此龙爪果70%醇提物对卷烟的抽吸效果改善最明显。

表 1 不同体积分数乙醇提取物感官评吸结果Tab.1 Results of sensory evaluation of extracts from ethanol solvents with different volume fraction

2.2 龙爪果70%醇提物的裂解产物分析

烟用原料的分析常采用裂解分析，在裂解仪中通过控制氧氮比、气体流速、裂解升温程序等模拟烟支燃烧时的条件，并将裂解后形成的挥发性产物进行捕集。常用的捕集方式有冷阱捕集、吸附剂吸附（如固相微萃取）等。冷阱捕集的效果要优于吸附剂，这是由于在−60 ℃的低温条件下，挥发性组分可以全部冷凝下来，而吸附剂由于其所具有的选择性，不能使全部组分被吸附。因此本研究采用−60 ℃冷阱捕集裂解产物，并在5 min内快速升温至280 ℃，使这些产物汽化进入气相色谱。

图 1 龙爪果70%醇提物的热裂解产物总离子流图Fig.1 Total ion current diagram of pyrolysis products of 70%ethanol extract of Hovenia dulcis fruit

从表2 可知，龙爪果70%醇提液裂解后形成的挥发性产物中能被鉴定出的化合物占84.13%，按照相对百分含量从高到低依次为：有机酸类26.68%、呋喃类15.79%、吡喃类7.75%、醇类12.33%、酮类9.56%、吡咯类4.78%、芳香族化合物1.64%、酯类1.49%、醛类1.39%、醚类1.12%。

检出的有机酸类包括甲酸、乙酸、丙酸等小分子有机酸和棕榈酸、亚油酸、油酸、硬脂酸等高级脂肪酸，这些有机酸类物质在卷烟烟气中自然存在，对卷烟的香味、吃味、余味均有影响。小分子酸与烟气的刺激性显著相关，含量适中时可使烟气有劲头，但过高则使烟气刺激性提高，高级脂肪酸类可中和游离烟碱，调节烟气pH 值，降低烟气刺激性，使烟气醇和适口，量过高则会使烟气有脂蜡味[21-22]。

呋喃类化合物中的糠醛、糠醇、5-甲基糠醛是卷烟主流烟气中重要的风味物质[23]；吡喃类化合物中占比最大的2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮可使卷烟的香气质有一定的改善，香气量有明显提升[24]；吡咯类化合物中甲基吡咯、2-吡咯烷酮都是卷烟主流烟气的重要成分，其形成与脯氨酸有关[25]；醇类化合物中占比最大的甘油是卷烟工业中常用的保润剂，2,3-丁二醇也具有保湿作用；酮类化合物中含量最大的2,3-己二酮具有甜的奶油、焦糖、水果气味，可使烟气丰富；醛类化合物仅检出壬醛，该化合物具有玫瑰、柑橘等香气；酯类化合物的含量较低；芳香族化合物中的2-羟基-5-甲基-苯乙酮是烟草香料的一种，3,4-二甲氧基苯酚具有甜香、木香、药香、烟熏香，可使烟气丰富，掩盖杂气。

表 2 龙爪果70%醇提物的热裂解产物Tab.2 Pyrolysis products of 70% ethanol extract of Hovenia dulcis fruit

续表 2

从70%醇提龙爪果的裂解产物来看，其在燃吸条件下形成的化合物有些本身存在于卷烟烟气中，大部分都有致香作用，与卷烟烟气协调，可提升烟气的香气质和香气量，增浓和丰富烟气，降低烟气刺激性，改善吃味，且产物中未见其他一些天然提取物裂解时会出现的有害的稠环芳烃类化合物，因此说明龙爪果70%醇提物适合用于卷烟产品中，可进一步开发利用。

2.3 Maillard 反应

含水率57.6%的新鲜龙爪果中还原糖含量可达18%以上，氨基酸种类丰富，含量在7 mg/g 以上[4]，可作为Maillard 反应型香料的原料，通过氨基酸和还原糖的合理搭配，使得反应产物的加香效果更优于原来的提取物。

依据方法1.3.4 进行Maillard 反应，得到龙爪果70%醇提物的Maillard 产物，按照方法1.3.2.1进行卷烟加料，并按1.3.2.2 进行感官评价，结果见表3。

从表3 可以看出，龙爪果70%醇提物的Maillard产物评吸效果优于其醇提物，反应产物在提升卷烟的香气质、香气量，提升烟气浓度，使烟气更细腻、降低烟气刺激性、产生回甜等方面优于醇提物，可以更好地改善抽吸效果。该Maillard 反应产物可用于梗丝、薄片、低次烟叶的提质，以及降焦减害卷烟产品的增香提质。

表 3 龙爪果70%醇提物及其Maillard 反应产物应用评价比较Tab.3 Evaluation and comparison of 70% alcohol extract of Hovenia dulcis fruit and its Maillard reaction products

3 结 论

龙爪果70%醇提物的裂解产物中含有大量可改善卷烟抽吸效果的风味化合物，其中主要是有机酸类化合物26.68%、呋喃类化合物15.79%、吡喃类化合物7.75%、醇类化合物12.33%、酮类化合物9.56%、吡咯类化合物4.78%、芳香族化合物1.64%、酯类化合物1.49%、醛类化合物1.39%，且其裂解产物中未见天然提取物中常见的有害稠环芳烃类化合物，说明该提取物适用于卷烟工业。为了进一步提高该提取物在卷烟中的应用效果，以其为原料进行Maillard 反应，其反应产物的加香效果更佳，有利于其在卷烟工业中的推广使用。