组蛋白乙酰化在肝纤维化中的研究进展

孙苏敏，开 钧，苏 莹，李章昊，夏思伟，葛 蒲，张自力,2，3，邵江娟,2,3，张 峰,2,3，郑仕中,2,3

(南京中医药大学1.江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，2.江苏省中药功效物质重点实验室，3.中药品质与效能国家重点实验室(培育)，江苏 南京 210023)

肝纤维化是由各种慢性刺激所引起的病理修复过程，以细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的过度沉积为主要特征。人体长期处于肝纤维化状态，肝脏实质会逐渐被瘢痕组织所替代，最终引发肝硬化甚至肝癌。肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)是ECM最主要的来源，抑制HSC活化对肝纤维化具有逆转作用[1]。参与HSC活化的信号途径众多，如自噬、内质网应激、氧化应激、视黄醇和胆固醇代谢等。此外，由枯否细胞、肝窦内皮细胞、自然杀伤细胞等分泌的细胞外信号也能进一步激活HSC。

组蛋白乙酰化是目前研究最为广泛和深入的表观遗传修饰之一，在染色质重塑和基因调控中发挥关键作用。新近研究表明，肝纤维化患者体内的表观遗传修饰与正常状态下相比存在显著差异，例如组蛋白乙酰化的位点和水平[2]。组蛋白乙酰化修饰主要由组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase，HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)两类酶调节，二者失衡会导致病理变化。大量研究表明，HAT与HDAC在调控HSC增殖和活化过程中发挥重要作用。同时HDAC抑制剂对于肝纤维化的治疗作用也不断得到证实。鉴于此，该文就近年来组蛋白乙酰化在肝纤维化中的研究作一综述，旨在为肝纤维化的病理机制与相关治疗药物的研发提供新视角、新靶标。

1 组蛋白乙酰化概述

组蛋白是染色体基本结构蛋白，大多数真核细胞中含有 5种类型组蛋白，分别为H1、H2A、H2B、H3和H4。真核生物的组蛋白与DNA一起组装，形成染色质。染色质可分为常染色质和异染色质。常染色质结构疏松，处于伸展状态，是基因表达活跃的区域；异染色质聚积程度高，结构致密，不利于基因的表达。研究表明，染色质的缩合程度，以及最终是形成常染色质还是异染色质，部分取决于组蛋白的表观遗传修饰[3]。因此，从某种程度上来说，组蛋白乙酰化通过调节染色质的聚合程度，在转录调控中发挥关键作用。

组蛋白乙酰化修饰是在组蛋白N端尾部的赖氨酸ε位的氨基处加上乙酰基，该过程可逆。组蛋白中富含碱性氨基酸精氨酸和赖氨酸，带正电荷，可与DNA中带负电荷的磷酸基团相互作用，形成紧密堆积的异染色质。在组蛋白发生乙酰化修饰后，N端赖氨酸所带正电荷减少，促进DNA从组蛋白八聚体上解离，此时核小体结构松弛，形成常染色质，促进基因转录[3]。组蛋白乙酰化主要由HAT和HDAC两类酶进行调控，在正常情况下处于动态平衡。

HAT是将乙酰辅酶A的乙酰基转移至组蛋白N端尾部赖氨酸残基上的一组酶。人和哺乳动物中主要有3个HAT家族: p300/CREB结合蛋白(p300/CBP)家族、MYST家族和GNAT(GCN5相关N乙酰转移酶)家族。此外，还包含一些转录因子和核受体辅激活物[4]。HAT与正常细胞的增殖、分化密切相关，变异可引发癌症等人类疾病。其中，p300/CBP是同源转录辅激活因子，参与多种细胞过程。MYST家族是一组进化相关蛋白，其中包含5个重要的人类HAT：MOZ、MORF、HBO1、MOF和Tip60。GNAT家族是在乙酰相关序列和若干同源区相似的一类蛋白，主要包含GCN5、PCAF、HAT1、ELP3、ARD1等。HAT除了对组蛋白具有生物活性，对非组蛋白也具有一定活性。此外，赖氨酸乙酰化在胞质和细胞核中还具有许多与表观遗传学或基因表达无关的功能。

HDAC是去除赖氨酸残基上乙酰基的一类蛋白酶。迄今为止，已经鉴定出18种哺乳动物HDAC。根据其结构和作用机理，可将其分为4类：I类HDAC(HDAC 1、2、3和8)，Ⅱ类HDAC(HDAC 4、5、6、7、9和10)，Ⅲ类(Sirtuin家族：Sirt1-Sirt7)和Ⅳ类(HDAC 11)。Ⅱ类HDAC可进一步分为两个亚组：具有质-核穿梭特性的Ⅱa类(HDAC 4、5、7和9)和具有两段催化区域的Ⅱb类(HDAC6和10)。Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ类为Zn2+依赖型HDAC，并具有相似的去乙酰基结构域，这表明单个化合物可以同时抑制Zn2+依赖型HDAC。而Ⅲ类HDAC在催化过程中依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)[5]。

HDAC与HAT之间存在活性竞争，组蛋白在HAT的催化下通常促进相关靶基因的表达，HDAC则促使常染色质向异染色质转化，进而导致基因沉默[3]。当 HAT与 HDAC之间失衡时会引起基因调控紊乱，此时疾病相关基因表达失调可导致癌症、自身免疫性疾病、慢性炎症等疾病的发生。目前组蛋白乙酰化修饰正逐渐成为疾病治疗研究的一大热点。

2 组蛋白乙酰化与肝纤维化

2.1 HAT与肝纤维化当前关于HAT对肝纤维化治疗作用的研究仍在少数，主要集中在p300。

2.1.1p300在HSC活化与EMT过程中的作用 Dou等[6]创新性地发现p300在高硬度基质诱导的人和小鼠的HSC中发挥重要作用。基质硬度为细胞外物理力学因素，由基质蛋白过度沉积及交联所致。高硬度基质通过激活RhoA-Akt信号通路诱导p300核积聚，p300通过表观遗传修饰促进α-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin，α-SMA)、结缔组织生长因子以及CXCL12、IL11等一系列促成纤维和肿瘤因子p300依赖性转录。

随后的研究表明，p300在HSC向肌成纤维细胞转化过程中对转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)具有双重作用[7]。TGF-β是最有效的促纤维化因子之一。p300既可作为Smad2/3和WW结构域的转录调节蛋白1从胞质转运到细胞核的穿梭体，又可发挥典型的乙酰化作用，使组蛋白乙酰化并重塑染色质以促进TGF-β的表达。此外，TGF-β也可反作用于p300，它在上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程中通过干扰p300/CBP的募集损害肝细胞核因子1α(hepatocyte nuclear factor 1α，HNF1α)的功能活性[8]。EMT是上皮细胞转化为具有转移和浸润特性的间充质细胞的一种生物学过程，主要受TGF-β信号通路调节。HNF1α是调节肝脏基因表达的转录因子之一，它在抑制炎症、纤维化和EMT过程中发挥关键作用。p300/CBP作为转录辅激活因子，不仅能连接转录因子与基础转录装置，还能发挥其HAT功能，将染色质乙酰化使其结构疏松利于基因转录。TGF-β不影响HNF1α与DNA的结合能力，但它阻碍HNF1α与靶基因启动子上的p300/CBP相互作用。核小体高乙酰化是HNF1α激活组织特异靶基因所必需的，p300/CBP的缺乏使靶基因启动子内HNF1α结合位点的染色质乙酰化水平局部降低，抑制了HNF1α的转录功能。

2.1.2HIF-1α/p300复合物参与肝纤维化进程 在肝纤维化进程中多伴随缺氧现象，缺氧可通过介导慢性炎症、ECM沉积促进疾病发生发展。缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1alpha，HIF-1α)是响应低氧应激的关键转录因子，HIF-1α有利于HSC的激活，并加快肝纤维化进程。在低氧条件下，p300与HIF-1α之间存在相互作用。HIF-1α在细胞核内招募p300，形成HIF-1α/p300复合体后，再与缺氧应答元件结合，进而实现对靶基因表达的调控。有研究表明，通过阻断HIF-1α/p300蛋白与蛋白之间的相互作用，可以抑制HIF的活性[9]。因此，抑制HIF-1α/p300复合物的形成可能是治疗肝纤维化的潜在方法。

2.1.3mTORC1/p300信号通路与肝纤维化 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)与细胞生长、代谢密切相关，参与自噬过程的多个阶段。研究表明，乙酰转移酶p300是mTORC1的新靶点，mTORC1通过磷酸化p300消除其分子内抑制而激活p300[10]。p300促使自噬相关蛋白(LC3、Atg5、Atg7)乙酰化，影响蛋白自噬活性，最终抑制细胞饥饿诱导的自噬并促进细胞脂肪生成。AMPK-mTOR信号通路是调控自噬的一个重要通路。AMPK是调节能量代谢的关键分子，饥饿等状态下的细胞AMP/ATP比值增大诱导其激活，AMPK通过抑制mTOR活性促进细胞自噬发生。研究表明，3种天然产物联合抑制AMPK-mTOR信号通路可以通过抑制 HSC自噬发挥抗肝纤维化作用[11]。p300作为mTOR新发现的下游靶点，提示其可能通过抑制HSC自噬保护肝纤维化。当然，目前还没有研究证明这一点，甚至与前文p300促进肝纤维化作用背道而驰，猜测p300可能对肝纤维化存在双重调控作用，这还需进一步的研究验证说明。

综上所述，p300通过多种途径参与肝纤维化发展进程，很可能是抑制肝纤维化的关键靶点。近年来，研究发现姜黄素、白藜芦醇、山竹子素等多种天然产物具有调控p300的功能，可能为肝纤维化的相关研究提供新的思路和策略。以表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)为例，EGCG是已知的p300抑制剂，且具有减轻肝纤维化和肝损伤的作用，提示其可能通过调控p300抑制肝纤维化进程。

2.2 HDAC在HSC活化中的作用相比于HAT，研究者将更多的目光放在了HDAC与肝纤维化的相关研究上。HDAC参与调节HSC的激活和肝纤维化病理进程，但在HSC转化过程中，各HDAC的表达并不完全相同。

2.2.1Zn2+依赖型HDAC 早在十年前，Mannaerts等[12]就发现Ⅰ类HDAC在HSC激活过程中发挥作用。其中HDAC1、2在HSC激活过程中蛋白表达水平降低，HDAC3几乎恒定表达，HDAC8则在HSC转分化时被诱导。在随后的研究中，又证实Ⅱ类HDAC在HSC活化过程中的重要作用[13]。所有Ⅱ类HDAC在HSC活化过程中持续表达，但HDAC9、10的mRNA表达水平显著下降。机制研究发现，Ⅱ类HDAC抑制剂MC1568可通过诱导miRNA-29抑制HSC活性。

有研究指出，在肿瘤坏死因子-α或脂多糖的刺激下，HDAC1可与NF-κBp50/50同源二聚体相互作用，通过抑制人HSC中骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制剂(bone morphogenetic protein and activin membrane-bound inhibitor，BAMBI)转录促进Toll样受体-4(toll like receptor-4，TLR-4)介导的肝纤维化进程中TGF-β的信号传导[14]。Li等[5]研究发现，在CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型中，Ⅰ、Ⅱ类HDAC的mRNA表达水平显著升高，其中HDAC2的表达增加的最为明显。siRNA干扰HDAC2表达后，TGF-β1激活的HSC-T6细胞发生细胞周期阻滞，且I型胶原α1和α-SMA蛋白的表达水平降低。进一步机制研究表明，HDAC2可能通过降低Smad7的表达水平发挥抗纤维化作用。Qin等[15]研究发现，HDAC4通过调控基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的表达影响HSC的活性。MMP属于内肽酶家族，具有降解ECM的功能。它们由静止的HSC产生，通过释放生长因子、促进细胞迁移和维持ECM动态平衡在组织损伤和伤口愈合中发挥重要作用。当HSC活化时，即使在炎症刺激下，也无法表达大多数MMP。在静息状态的HSC中过表达HDAC4能够抑制IL-1对MMP9和MMP13的活化作用，降低内源性MMP9的表达，这证明MMP基因沉默的表观遗传学机制依赖于HDAC4。此外，HDAC4在HSC激活过程中可被招募到Sirt1启动子附近，通过降低组蛋白H3和H4的乙酰化水平抑制Sirt1的表达[16]。Sirt1通过催化过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferater-activated receptor γ，PPARγ)去乙酰化抑制小鼠HSC活化。据文献报道，抑制HDAC1、2、4可诱导活化的HSC凋亡和自噬性细胞死亡[17]。

HSC活化与组蛋白去乙酰化之间另一个联系是HDAC7对肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)表达的调节[18]。HGF为抗纤维化介质，在肝脏中通过多种机制保护肝纤维化和抑制HSC活化。HDAC7可与HGF的启动子结合，通过抑制HGF的基因转录促进纤维化的发生发展。Yang等[19]则发现，HDAC9参与了虾青素在HSC中的抗纤维化作用。在小鼠HSC激活过程中，HDAC9 的mRNA和蛋白水平显著增加。肌细胞增强因子2(myocyte enhancer factor 2，MEF2)是诱导HDAC9表达的转录因子，在HSC转化过程中MEF2a、MEF2c和MEF2d 的mRNA水平也显著升高。此外，LX-2细胞中的HDAC9经 siRNA转染沉默后抑制TGF-β1诱导的α-SMA、I型胶原α1等纤维生成基因的表达。

2.2.2NAD+依赖型HDAC 近年来也有不少研究聚焦于Ⅲ类去乙酰化酶Sirtuin家族在HSC活化中的作用，越来越多的证据表明Sirt1在调节肝脏病理生理过程中具有保护作用。Ramirez等[20]报道衰老通过下调Sirt1的表达加重小鼠酒精性肝损伤和纤维化。血小板衍生生长因子受体α(platelet derived growth factor receptor alpha，PDGFR-α)可增强TGF-β信号，是影响HSC活化的重要因素之一。c-Myc是促进HSC激活和增殖的重要癌蛋白。腺病毒介导的Sirt1过表达通过降低PDGFR-α和c-Myc的表达水平抑制年长小鼠的HSC激活，而HSC中特异性敲除Sirt1则有利于年轻小鼠HSC的激活。此外，Sirt1通过其介导的果蝇zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)去乙酰化调控小鼠HSC中PPARγ的转录，PPARγ是成纤维细胞转分化和肝纤维化的抑制因子，抑制EZH2或激活PPARγ可能改善Sirt1缺失小鼠的肝纤维化[21]。不仅仅是HSC，在其他可能成为肌成纤维细胞来源的细胞中，例如上皮细胞和内皮细胞，Sirt1缺失也会导致更严重的器官纤维化。

除Sirt1之外，Sirtuin家族的其他酶也显示出对HSC激活的作用。有研究发现，通过使用抑制剂或shRNA阻断Sirt2活性可以显著抑制LX2 、JS1细胞和小鼠HSC中纤维化基因的表达[22]。机制研究表明，Sirt2被抑制后可能通过降低细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)的磷酸化水平影响c-Myc的稳定性，而c-Myc的降解不利于HSC的激活。Sirt3则通过TGF-β/Smad信号通路起到抗纤维化的作用，其过表达可显著抑制LX-2和HSC-T6细胞的活性[23]。Sirt3通过其去乙酰化作用激活超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD2)，进而减少线粒体内活性氧(reactive oxygen species，ROS)的积累，降低Akt活性，最终抑制TGF-β1的产生和分泌。另外，Sirt3介导的糖原合成酶激酶-3β去乙酰化可通过降解Smad蛋白阻碍肝纤维化的发生发展。此外，Sirt3是琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase，SDH)活性的主要生理调节因子，Sirt3缺失使SDH活性降低，此时SDH催化琥珀酸氧化为延胡索酸的能力减弱，琥珀酸浓度升高，蓄积的琥珀酸可通过结合HSC上的G蛋白偶联受体91(G protein-coupled receptor 91，GPR91)激活HSC[24]。

综上所述，HDAC参与了HSC的激活和肝纤维化的进展。然而，对比研究结果，我们发现其中存在一些矛盾之处，例如HDAC9在HSC转化过程中的mRNA水平在Mannaerts等[12]和Yang等[19]的研究中呈现出完全相反的趋势。研究人员推测这可能因为HDAC基因表达存在动态变化，亦或是由于肝脏是多种细胞类型组成的混合体，而具体是哪种细胞类型负责HDAC的表达还有待进一步确认。目前关于HDAC在肝纤维化中的各种特征性认识尚处于起步阶段，还需要更深入的研究阐明各单一HDAC在肝纤维化中的确切机制，为以后研制特异性抑制剂、制定治疗方案提供更精确的靶点。

3 HDAC抑制剂治疗肝纤维化的研究进展

大量研究证实了HDAC在肝纤维化中的调控作用，因此HDAC很可能是药物发挥疗效的关键靶点，研究HDAC抑制剂可能是治疗肝纤维化的一个重要策略。曲古抑菌素A广泛抑制Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ类HDAC，通过使Smad3/Smad4转录复合物失活，并干扰I型胶原启动子的转录辅激活因子p300与Smad3结合发挥抗EMT的作用[25]。此外，曲古抑菌素A还可以通过提高HSC中赖氨酸乙酰化水平，增加CCAAT增强子结合蛋白-α(CCAAT enhancer binding protein-α，C/EBP-α)的表达，促进C/EBP-α诱导HSCs凋亡[26]。丙戊酸相比于曲古抑菌素A，特异性更高，毒性也更低。丙戊酸选择性抑制I类HDAC，通过抑制炎症、增加组蛋白H4乙酰化水平、抑制细胞因子和ROS、增加Mmp2表达等多种途径减轻纤维化[27]。此外，丙戊酸还可以通过抑制肝纤维化过程中的EMT影响HSC的激活[28]。Largazole是从蓝藻中提取出的环肽内酯类化合物，特异性抑制I类HDAC。相较于曲古抑菌素A和丙戊酸，Largazole更加高效。Largazole通过增加HSC中组蛋白H3和H4的乙酰化水平、抑制TGF-β和血管内皮生长因子信号，减少肝纤维化和血管生成[29]。

新近研究评估了8种人类HDAC抑制剂(包含广谱抑制剂和Ⅰ、Ⅱ类特异性抑制剂)在肝脏炎症和纤维化的发生、发展过程中的作用。研究结果发现I类(而非Ⅱ类)HDAC抑制剂可在硫代乙酰胺诱导的小鼠肝细胞应激和肝损伤中有效抑制2型细胞因子驱动的肝炎症和纤维化[30]。由此可见，相比于Ⅱ、Ⅳ类HDAC，对于Ⅰ类HDAC特异性抑制剂的研究似乎具有更高的临床价值和意义。

4 结语

组蛋白乙酰化修饰是一种复杂的调控机制，迄今为止，我们对于其在肝纤维化中的认识仍处于起步阶段。目前关于HAT在肝纤维化进程中的研究仍在少数，主要集中在p300/CBP家族，可以明确的是，p300/CBP是抑制肝纤维化的关键靶点。更多的研究集中在HDAC，但机制研究并不深入，不同研究间甚至存在矛盾之处。想要挖掘组蛋白乙酰化在肝纤维化中的治疗潜力，必须明确HSC、KC、肝细胞等肝脏主要组成细胞在疾病和正常状态下HAT和HDAC的表达谱。另一方面，HDACI在肝纤维化实验模型中的作用是明确的，其很可能成为防止或减轻肝纤维化不良反应的潜在药物，但非特异性的HDACI仍存在很大的潜在副作用。因此，在之后的研究中有必要权衡好HDACI的效价与毒性关系，同时着力于开发具有更高靶向和选择性的新型HDACI。综上所述，组蛋白乙酰化很可能为肝纤维化的病理机制研究和治疗药物的研发提供新的视角和靶标。