乳腺癌预防模型研究进展

徐格格 张宇 刘维芳 石爱平 (吉林大学白求恩第一医院乳腺外科，吉林 长春 130021)

随着晚育少育的趋势上升，世界范围内乳腺癌的发病率在不断攀升〔1〕，在我国乳腺癌是女性最常见的癌症，也是中国女性第六大癌症死因〔2〕。根据美国国立综合癌症网络(NCCN)数据，目前全世界公认的乳腺癌预防手段主要是调整生活方式，包括减少酒精摄入、维持健康体重和化学药物预防〔3〕，方法有限，因此对于乳腺癌预防的研究急需有较大突破和进展。可应用于乳腺癌预防性研究的实验模型可以保证实验结果的真实性、客观性和有效性，从而能对乳腺癌进行有效预防，降低乳腺癌发病率。现阶段大多数研究都是通过建立动物模型或特定细胞株来研究乳腺癌在体内发生发展的规律及检测药物预防肿瘤发生的有效性，现将可用于预防乳腺癌的实验模型综述如下。

1 体外实验模型

1.1雌激素诱导正常乳腺上皮细胞发生恶性转化 雌激素作为一个重要的影响因子调控着乳腺的发生发育，同时也被看作是乳腺癌发生的诱因之一〔4〕。体内雌激素水平过高，月经开始早，停止晚造成的雌激素暴露时间过长，都大大增加了乳腺癌患病的风险，因为乳腺腺体在雌激素的作用下，可能由普通增生变为肿瘤形成，这与雌激素受体本身调控细胞增殖有关〔5〕。雌激素也可以促进细胞具有侵袭性，转移性，并且这种改变与调控细胞增殖能力无关〔6〕。此外，雌激素在体内、外均被证实具有基因毒性，可导致多种类型的DNA损伤，从而导致乳腺癌的发生〔7〕。

Fernandez等〔8〕发现，用70 nmol/L的雌二醇及其代谢产物羟雌二醇、羟基雌二醇处理密歇根癌症基金会(MCF)-10F细胞，每周两次，共2 w，处理后传代6～12次，可以诱发正常乳腺上皮细胞基因突变从而致癌。Russo等〔9〕用雌二醇在传代前三次处理MCF-10F细胞，满1 w后再处理48 h，传代10次后的细胞4号染色体缺失，细胞特性表现为侵袭能力增强，成管能力增加，发生了细胞恶性转化，再次印证雌激素具有致癌性，并可依此建模。

1.2培养出的可移植细胞系 MCF-10A细胞系是来源于人的永生化正常乳腺上皮细胞系，激素受体阴性，人表皮生长因子受体(Her)-2基因扩增阴性，转染T24Ha-ras后可发生细胞恶性转化成为MCF-10AT细胞系，侵袭能力增加，可视为发生癌前病变，转染成功后可直接进行体外实验，用于试验抗肿瘤药物及乳腺癌发生机制的研究，也可移植于小鼠体内建立乳腺癌癌前病变动物模型行体外实验〔10〕。

乳腺癌预防研究的体外实验模型主要为细胞实验，主要是加入药物或给予乳腺癌发生条件加以诱导，使正常的乳腺上皮细胞获得乳腺癌细胞的生物学特性，例如细胞的恶性转化。本方法的优点是可对影响肿瘤发生的单一因素进行控制，干扰因素较少，非常适合研究乳腺肿瘤发生的机制，寻找乳腺癌预防性研究的切入点，也适用于抗肿瘤药物的研究，尤其是筛药实验，相较于动物实验花费低、操作更简便；应用人源性细胞株进行实验，相比动物模型，物种差异性更低，更贴近人类乳腺癌细胞的生物学特征。

2 体内实验模型

2.1自发性乳腺癌模型 自发性乳腺癌模型是指未经人工手段干预，某些品系的实验鼠类到达一定年龄阶段可自然发生乳腺癌或者通过遗传育种技术培养出具有相同特点的一类动物模型。自发性乳腺癌动物模型多采用近交系小鼠，目前培育出的品系主要有C3H系、TA2系、SNH系和615近交系等，其中C3H小鼠、TA2小鼠和SNH小鼠为高癌系小鼠，615近交系小鼠为低癌系小鼠。SNH小鼠是由兄妹交配维持下来的一种自发性乳腺癌动物模型，其最突出的特点为短时间内癌变率高，出生4个月时即可出现症状，12个月时发病率达100%。目前SNH小鼠是研究乳腺癌发病机制、多级预防和治疗的良好模型。已有文献报道，用不同成分饲料喂养SNH小鼠可影响其肿瘤的发病率，故将此动物模型投入实验中需要考虑饲料中营养成分的影响〔11〕。TA2小鼠是天津医科大学在1963年继TA1小鼠培育出的自发性乳腺癌模型，基因表型稳定，乳腺癌发病率高，且病理学形态特征与常见的人浸润性乳腺癌相似，而免疫表型与人类三阴性乳腺癌非常相似，因而TA2小鼠是一个良好的乳腺癌动物模型，能最大限度地模拟肿瘤在人体内发生发展的过程。并且，雌孕激素可以增加TA2小鼠乳腺癌发病率，而妊娠期小鼠体内有较高水平的雌孕激素，所以经产小鼠的发病率高于处女鼠。C3H小鼠6～10个月时乳腺癌自发率高达85%～100%，特殊的是乳腺癌通过乳汁传播，而非胎盘传播或垂直传播。615近交系小鼠是由我国自主培育的，具有较易饲养繁殖，性情温顺的特点。615小鼠不仅可自然发生乳腺癌，还会发生肺腺癌和恶性淋巴瘤等，小鼠在15～18个月时乳腺癌的发病率为6.7%，且发病全为经产雌鼠，在615小鼠的自发瘤中位于第二位。

自发性乳腺癌模型最大的特点即无需任何处理，到达一定年龄阶段动物可自然发生乳腺癌，这一特点在目前已有的乳腺癌发生模型中与人类发病最为相似。因此，目前自发性乳腺癌模型是体内实验中最为适用于研究乳腺癌的病因、发生发展和防治，尤其是预防性用药。但是自发性乳腺癌动物模型实验周期长，实验过程中易受到各种非实验因素的影响，导致实验结果偏倚大，并且花费较多。

2.2诱发性动物模型 诱发性动物模型是指用不同剂量的物理、化学或生物因素在不同时长下处理动物，诱导其发生乳腺癌。目前最常用的方法为利用化学制剂诱导乳腺癌动物模型建立，二甲基苯甲酸烷(DMBA)和N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)两种致癌剂对乳腺组织有较高的选择性和特异性，因而最为常用，本文主要介绍这两种化学致癌剂建立乳腺癌模型的特点。

作为致癌剂，DMBA进入细胞内需要经过羟基化、环氧化等代谢过程最终产生致癌物,才能使细胞中原癌基因活化,诱导肿瘤发生，而MNU则可直接在细胞内富集损伤DNA，使基因发生点突变，诱导大鼠发生肿瘤〔12〕。可用于化学诱导剂建模的实验动物包括大鼠、小鼠、兔和犬等，其中大鼠饲养方便，成本较低且成瘤周期较短，故最常选用。SD大鼠、Wistar大鼠、Zucker大鼠和Fischer 344大鼠都可用于建模，但考虑到饲养条件、经济方面、实验室饲养经验及购买方便性等因素，在我国最常用于建模的大鼠品系为SD大鼠和Wistar大鼠。SD大鼠对MNU敏感性相对较高，因而是最适合于MNU诱导建立乳腺癌模型的实验动物。

化学致癌剂一般采用口服(灌胃)、局部涂抹(乳房皮肤表面)、皮下注射、腹腔注射及静脉注射的方式给药。MNU在胃肠道给药毒性大〔12〕，口服途径给药致死率较高，不建议采用灌胃方式给药，多采用尾静脉注射或腹腔注射的方式。DMBA可通过多种方式给药，DMBA是脂溶性物质,灌胃给药时需将其溶解于植物油或吐温，因为其经过体内代谢后才能转变为致癌剂发挥作用。

根据实验需求选择正确的鼠龄建立乳腺癌模型十分重要。大鼠哺乳期约在4周龄时结束，此时大鼠乳腺的导管迅速生长、形成分支，终末乳腺导管和终末芽体开始出现，上皮细胞增生十分活跃，细胞周期较短，因此对化学致癌剂的易感性较高，待到大鼠6周龄进入到性成熟期，导管上皮的生长速度与4周龄相比较为缓慢，对化学致癌剂的敏感性也相对下降，但是大鼠体内雌激素水平较高，因而可以维持较高的乳腺癌发生率，若大鼠经产和哺乳后，乳腺导管结构则分化良好，此时对致癌剂的敏感性降到最低〔13〕。

目前多选用性成熟期的大鼠进行诱导，DMBA给药8～12 w即可发生乳腺癌，发生率接近100%，并且在肿瘤生长的过程中伴随大鼠体重下降。两种化学致癌剂诱发建立的动物模型皆为激素受体阳性乳腺癌，但是MNU诱导出的乳腺癌模型Ki-67更高，侵袭能力更强〔14〕。

除应用性成熟期大鼠建立化学诱导性乳腺癌模型外，Thompson等〔15〕给予3周龄未性成熟大鼠注射MNU，目的是观察不依赖大鼠体内的性激素轴化学致癌剂能否建立乳腺癌模型，在用药35 d后，60%大鼠的乳腺长出了肿物，并且>99%的肿物为包括腺癌、浸润癌和导管原位癌在内多种类型的乳腺癌，而用同样的方法DMBA诱导大鼠产生的多为良性病变。这一结果证明了除性激素外或许有其他因素可以影响化学致癌剂作用下大鼠乳腺肿瘤的发生和进展。

MNU诱导的大鼠乳腺肿瘤与人类的肿瘤组织起源相似〔16〕，多为导管上皮的病变，并且有报道证实即使在已行双侧卵巢切除术的大鼠体内，乳腺终末导管依旧可以延长生长到脂肪垫中〔7〕。为了进一步验证性激素在化学致癌剂诱导未性成熟大鼠肿瘤发生过程中的作用，Thompson等〔15〕给予注射过MUN 1 w后的3周龄大鼠双侧卵巢切除术，发现性激素可以促进乳腺肿瘤从癌前病变向癌变发展，并且其发生的肿瘤多为非激素依赖性。鉴于在未发育性成熟大鼠体内，MNU诱导发生的恶性肿瘤比例高、DMBA诱导发生的良性肿瘤多及性激素在肿瘤由良性向恶性发展的过程中的促进作用，Wang等〔17〕选用4周龄大鼠，利用DMBA诱导加5 d的外源注射性激素模拟正常的月经周期，建立了稳定的乳腺癌癌前病变模型。

MNU单一给药在药量为50 mg/kg时，SD大鼠发生的乳腺癌具有除起源与人类乳腺癌相似的之外的另一个很重要特征——肿瘤具有异质性，这为我们研究肿瘤的发生发展提供了一个良好的模型。据报道，MUN还能改变大鼠肉瘤(Ras)/苏氨酸基酶(Raf)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷酸酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路，并引起p53,c-kit,雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和 c-myc基因的表达发生变化〔18〕。另外，相比DMBA，MNU虽然可以成功诱导雄鼠发生乳腺癌，但产生的肿瘤是非激素依赖性，Her-2阴性，与人类男性乳腺癌常见的激素依赖性类型不同，因此可能无法作为男性乳腺癌的可靠模型〔19〕。Kratzke等〔20〕将DMBA和MNU原本的剂量减少，将二者同时给予SD大鼠建立乳腺癌模型，发现二者在诱导乳腺癌发生上具有协同作用，可以在更短时间内使SD大鼠发生肿瘤。

化学致癌剂诱导建立乳腺癌动物模型操作简单，条件可控，诱导病变过程较为确切，便于我们根据不同的需求选择时间点观察。诱导方法多样，建立的乳腺癌动物模型也多样，包括激素依赖性和非激素依赖性肿瘤，且由于其与人类发生的乳腺癌有较多相似之处，因而常用于乳腺癌病因学和预防性研究。早些年，化学致癌剂建立模型周期较长、个体成瘤差异大，人们普遍认为此模型不适用于抗肿瘤药物的研究〔21〕，然而近些年来，由于与其他乳腺癌模型相比，化学诱导性模型更为稳定、造价较低且模型更为可靠，一些抗肿瘤药物尤其是天然成分研究的实验都选择此模型〔22～24〕。

2.3可移植动物模型 可移植性动物模型是指将恶性转化细胞、癌前病变或肿瘤细胞、组织移植到实验动物体内，建立出的动物模型。根据移植物的来源，可移植动物模型又分为同种移植动物模型和异种移植动物模型。此模型一般用于疾病发生机制和药物筛选的研究。

2.3.1同种移植 同种移植动物模型为用已建立好的鼠类乳腺癌细胞株或组织移植到小鼠体内，以建立出小鼠乳腺癌模型。目前同种移植建立的小鼠乳腺癌模型由于植入小鼠体内后无癌前病变的状态，不适用于乳腺癌的预防性研究。

2.3.2异种移植 异种移植建立乳腺癌动物模型的方法是将人源乳腺癌细胞株或发生恶性转化的细胞株移植到免疫缺陷小鼠(SCID)或裸鼠体内，使其发展成为乳腺癌。目前最常用的细胞株多为MCF-7、MDA-MB-231和SK-BR-3，受体表达分别为激素受体阳性、三阴性和Her-2阳性，移植成功率较高，成本较低，可以保证成瘤部位的特异性，实验周期与其他建模方法相比较短，但是由于无法观察到肿瘤在体内发生恶变的过程，也不适用于研究乳腺癌的预防性研究。除乳腺癌细胞株外，正常乳腺上皮细胞经过转染后可获得一些恶性细胞具有的特性，也可以用于异种移植建立模型。比如，发生恶性转化行为的MCF-10AT细胞系，可移植于裸鼠体内发生非典型增生、原位癌，最终有25%的模型发展成浸润性导管癌，从而建立乳腺癌癌前病变动物模型，MCF-10A本身为激素受体阴性的细胞株，经过转染后受体表达不发生变化，因此目前此动物模型是良好的用于研究预防三阴性乳腺癌的模型。

应用移植性动物模型成功率与其他模型相比较高，且所需时间较短。但是利用免疫缺陷小鼠建模，反应体系中缺少机体对肿瘤细胞产生的免疫反应，并非良好的乳腺癌机制预防性研究模型；裸鼠本身造价较高，对饲养条件要求也高，为研究乳腺癌的预防性实验增加了极大的阻力；同时目前可用于移植性建立乳腺癌癌前病变的细胞株单一，可研究的预防乳腺癌亚型也单一，并非全面可靠的乳腺癌预防性研究模型。

2.4转基因动物模型 近年来，转基因技术不断发展，技术逐渐成熟，现今已有多种小鼠乳腺癌模型可应用于乳腺癌病因及预防性研究中。转基因动物是指将目的外源基因或特定DNA片段导入动物受精卵中，使外源基因与动物本身基因整合，并且稳定地遗传给后代的一类动物〔25〕。

现已知有一些病毒和蛋白可作为启动因素来促进原癌基因在小鼠乳腺中表达，比如小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV-LTR)、乳清酸性蛋白(WAP)和小鼠金属硫蛋白(MT)1〔26〕。它们可以促进和调控某些原癌基因在小鼠乳腺中表达，例如原癌基因包括瘤中间T抗原(PyMT)、Harvery鼠肉瘤病毒ras基因(Ha-ras)、Wnt-1、Her-2/ErbB2/Neu和c-Myc等。若启动子将原癌基因在动物体内激活使其表达，则“转基因”成功。

原癌基因种类丰富、总体数量相对较多，在建立转基因小鼠时可只激活一种，称为单一的转基因小鼠，比较常用的是MMTV-PyMT小鼠、MMTV-Wnt-1小鼠和MMTV-ErbB2小鼠，其发病年龄分别在5 w、4～7个月和5～10个月；也可同时激活两种到三种的原癌基因，称为复合转基因小鼠，例如MMTV-neu，ras，myc小鼠，其发病年龄相对MMTV-ErbB2小鼠更早，约为72 d〔26〕。有报道证明MMTV-Wnt-1小鼠体内乳腺细胞内Wnt-1基因高水平表达，可以引起乳腺上皮细胞发生恶性转化〔27〕，进而发展成乳腺癌。MMTV-ErbB2小鼠体内，ErbB2信号通路被激活后通过调节乳腺干细胞和乳腺祖细胞的分布诱导乳腺癌的发生〔28〕，而在其癌前病变的乳腺组织中，管腔型祖细胞分布明显增加〔29〕。Maglione〔30〕等系统评估了MMTV-PyMT小鼠发生乳腺癌前早期发生恶性转化的病理特征，并对各个阶段乳腺上皮细胞的生长能力进行了比较，充分证明了MMTV-PyMT小鼠可以用于乳腺癌的预防性研究。

由于转基因动物发病时间相对较长，为了缩短建模所耗费的时间，将携带目的基因的病毒载体分离提纯后注入转基因小鼠乳腺腺管内可以使病变提早发生。Siwko等〔31〕将K19-tva转基因小鼠的第2，3，4对乳头剪掉，将禽肉瘤白血病病毒(ALSV-PyMT)载体注入腺体管腔中，并通过在腹部的侧切口观察病毒载体是否注入成功，在30 d后小鼠可发生乳腺非典型增生和导管原位癌样的癌前病变，3.3个月后发生可触及的浸润性癌灶，且肿瘤类型为激素受体阴性。Du等〔32〕将禽肉瘤白血病逆转录病毒(RACS-PyMT)注入6周龄的转基因小鼠的乳腺管腔内，平均12.5 d后小鼠即可出现多灶肿瘤。

目前利用转基因技术可建立符合乳腺癌四个亚型的模型，这为我们较为全面的研究乳腺癌发生发展提供了条件。然而鼠和人类的癌变发生发展过程并不完全相同，因此转基因动物并不能完全反映出人类乳腺癌的类型和特征，更不能保证在动物体内有效的抗肿瘤药在人体内也有效。

3 预防的节点

乳腺癌的发生是一个连续、动态的过程，从正常的乳腺上皮细胞、增生、非典型增生、原位癌，终有约25%发展为不同类型的浸润性癌。一般认为非典型增生包括三种，导管上皮非典型性增生，小叶非典型性增生和平坦型上皮非典型性增生，前两种被认为具有可以进展为乳腺癌的危险状态〔33〕，也被称为癌前病变。癌前病变是介于乳腺良性病变与乳腺癌中间的临界状态，目前认为此状态可逆，因此也是乳腺癌预防研究的重要节点，本文认为此节点应为预防手段干预乳腺癌发生的最后节点。

根据目前查阅到的乳腺癌预防性研究实验，现将实验预防的节点总结如下：在体外实验中，给予预防手段应在诱导乳腺上皮细胞发生恶性转化前或同时与诱导剂应用，对于MCF-10AT细胞可直接给予预防手段，观察细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力，也可以检测细胞信号转导通路的变化；化学诱导性模型进行实验时，可为给化学诱导剂前5～10 d和给药后几日内加入预防手段，而后观察实验动物的癌前病变检出率和成瘤率〔34,45〕。

4 结 语

对于乳腺癌，目前被公认的预防措施主要是调整生活方式，减少酒精摄入、控制健康体重和化学药物的预防。根据前瞻性实验研究结果，能有效预防乳腺癌的药物主要为雌激素受体拮抗剂他莫昔芬和雷洛昔芬，但雌激素受体拮抗剂仅可预防激素受体阳性乳腺癌发生，Her-2阳性乳腺癌和三阴型乳腺癌两种相对于预后较差的乳腺癌至今仍无有效的预防措施。乳腺癌的预防性研究方面仍有很多空白，因此，寻找建立合适的可应用于乳腺癌预防性研究的实验模型至关重要。

要研究如何预防乳腺癌，顾名思义，就要对乳腺癌发生之前的病理变化进行观察和研究。乳腺组织在发生癌前病变后可能会很快地进入癌变状态，因此癌前病变是乳腺癌发生前的重要节点，也是观察和研究最后的节点。所以，用于乳腺癌预防性研究的模型应至少具有发生癌前病变的过程。

实验设计者应在了解各种模型的优缺点之后，根据实验需求进行选择。无论是细胞模型还是动物模型都有其局限性，不能完全模拟人类乳腺癌的发生发展，目前仍无一种可以全面反映人类乳腺癌的模型，因此更简便、更经济、更符合实验要求的乳腺癌预防模型的建立将在研究乳腺癌的预防方面发挥巨大的作用，从而有望延长人类的预期寿命、提高人类的生活质量。