金葡菌感染引发的天然免疫防御效应研究进展①

石 婷 李甜甜 郑月娟

(上海中医药大学基础医学院，上海中医药大学上海市健康辨识与评估重点实验室，上海 201203)

金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus，S.aureus)简称“金葡菌”，属于革兰氏阳性(gram positive，G+)球菌，是引起院内和社区感染最常见的化脓性病原菌，寄居于人体的鼻腔、咽喉、肺、皮肤及肠道内，当机体免疫状态低下时可引发皮肤或软组织感染，如毛囊炎、蜂窝织炎、皮下脓肿或溃疡，入血后可导致菌血症、肺炎、脑膜炎、骨髓炎、脓毒血症等重症感染，严重威胁人类生命健康[1-3]。临床分离到的G+致病菌中，金葡菌的检出率位居第一[4]。目前抗生素仍然是临床抗感染治疗的首选药物。但近年抗生素滥用导致了金葡菌多重耐药性的不断进化。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcusaureus，MRSA)对多种临床一线抗生素耐药，导致临床治疗陷入窘境[5]。据2016年世界抗生素耐药情况调查统计，全球每年约70万人死于抗生素耐药性细菌感染，MRSA是其主要危险因素之一。2017年中国CHINET细菌耐药监测报告结果显示，MRSA的临床平均检出率连续5年持续超过30%，已成为致死风险最高的致病菌之一[4,6]。目前，万古霉素是临床治疗MRSA感染的一线抗生素，但日渐增多的万古霉素耐药株提高了临床抗MRSA感染治疗的复杂性[5，7-9]。尽管近年针对MRSA的新型抗生素研发已取得一定进展，但为防止新型抗生素耐药菌的产生，寻找新的治疗策略具有重要意义。

机体针对病原菌产生适度的免疫应答可有效清除病原菌。但机体免疫反应过弱不利于病原菌清除，机体免疫反应过强，则会引发系统性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)，导致机体组织损伤、多器官功能衰竭、脓毒症，甚至死亡。宿主导向治疗(host-directed therapy，HDT)是近年抗感染领域出现的新方法，通过调控感染过程中宿主过强的免疫反应，减少感染引发的过度炎症因子分泌，减少组织脏器损伤，避免耐药，从而保护机体、改善预后[10,11]。

金葡菌感染宿主是双方相互作用的动态过程，对宿主的致病性一方面取决于病原菌本身，另一方面取决于宿主免疫反应。金葡菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素(如溶血素、剥脱毒素、肠毒素、致热性外毒素、杀白细胞素和中毒性休克综合征毒素等)和侵袭性酶(如：血浆凝固酶)。为适应环境变化，金葡菌分泌胞外复合物形成生物膜包裹自身，附着在生物或者非生物表面，使膜内细菌逃避机体免疫系统的作用，同时阻止或延缓抗生素渗透。在抗感染过程中，宿主的天然免疫系统是机体发挥免疫防御效应的第一道防线，并启动获得性免疫。中性粒细胞、树突状细胞(dendritic cell，DC)、巨噬细胞(macrophage，Mφ)、肥大细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK cell)、γδ T细胞和固有淋巴样细胞(innate lymphoid cell，ILC)等是参与感染性疾病的重要天然免疫细胞。当病原菌入侵机体时，宿主的天然免疫细胞被迅速募集并激活，引发免疫应答反应。一方面可诱导机体产生促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、IL-1、IL-6等以及趋化因子，如单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)和巨噬细胞炎症蛋白(macrophage inflammatory protein 2,MIP-2),促进中性粒细胞和Mφ向感染部位聚集，并增强其吞噬功能[12，13]。另一方面，Mφ、中性粒细胞甚至DC还可吞噬、杀伤、降解入侵病原菌。随着病原菌被降解，其抗原肽可被专职抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)，如DC和Mφ提呈给T淋巴细胞，进一步激活宿主适应性免疫反应[14]。

天然免疫尤其是天然免疫细胞如何防御病原微生物感染是免疫学甚至生命科学领域的重要课题。本综述将重点讨论在金葡菌感染过程中宿主天然免疫细胞的防御效应，以期阐明金葡菌引起的重症感染的发病机理，寻找该类感染性疾病的防治靶标。

1 黏膜免疫屏障

皮肤黏膜、黏液及共生菌群所形成的屏障结构在抵抗外来微生物感染中发挥重要作用，包括表皮屏障、微生物屏障及化学屏障。黏膜上皮组织构成了机体内表面的物理屏障，包括上皮层和黏液层。上皮细胞排列紧密，分泌的黏液覆盖于黏膜表面，阻止金葡菌入侵；呼吸道上皮细胞披覆纤毛，纤毛有规律的摆动可使黏液向一定方向流动，阻止金葡菌附着，加快其排出[15]。人体的共生菌群是黏膜表面的优势菌群，通过竞争空间及养料产生抑菌物质，营造有利于自身生长而抑制其他病原菌生长的环境，构成微生物屏障[16]。

2 预存的天然免疫分子

参与天然免疫应答的体液因子在0～4 h发挥作用，是一类反应迅速的效应分子，如抗菌肽、溶菌酶、急性期蛋白、补体和细胞因子等。抗菌肽是具有抗菌活性的短肽，内源性抗菌肽经诱导而合成，具有广谱杀菌作用，高浓度的防御素与组织杀菌素插入细胞壁使其形成孔洞，细菌因细胞壁损伤而死亡[17]。溶菌酶属低分子量不耐热碱性蛋白质，具有溶菌活性，不仅可直接损伤金葡菌细胞壁的保守成分-肽聚糖(peptidoglycan，PGN)导致金葡菌溶解，还可激活补体和促进吞噬作用[18]。急性期蛋白是机体在应激(如感染)状态下发生变化的一组血清蛋白，可由TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子诱导巨噬细胞产生[19]。其中C反应蛋白可作为调理素结合金葡菌表面并活化补体，铁蛋白和结合珠蛋白等可阻止金葡菌的铁摄取。补体系统可通过甘露糖结合凝集素途径或旁路途径激活，在靶细胞表面产生攻膜复合体并介导细胞溶解。补体激活过程中产生的C3a、C4b和iC3b可固定于细菌表面，通过与吞噬细胞表面CR1、CR3或CR4结合而促进吞噬细胞的吞噬作用。

3 天然免疫识别

天然免疫细胞表面表达模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)可直接识别病原微生物生存的必要和保守成分-病原相关分子模式(pathogen-associated molecule patterns,PAMPs)，产生促炎介质，如细胞因子、趋化因子、黏附分子。在金葡菌感染时，Toll样受体2/6异二聚体(Toll-like receptor 2/6，TLR2/6)、NOD样受体2(nucleotide binding oligomerization domain-like receptors，NLR2) 和其他受体通过与细菌相应配体，如PGN、细菌脂蛋白和脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)等结合而被激活，导致炎症细胞因子产生和引起机体平衡失调[20]。在PGN 刺激下，TLR2 通过募集细胞内接头分子髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)而激活下游多条信号通路，从而诱导下游促炎细胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β等促进趋化因子MCP-1和抗炎细胞因子IL-10等产生[20,21]。除被TLR2/6 识别，PGN 也可被巨噬细胞中的溶菌酶消化，消化得到的PGN 保守成分胞壁酰二肽(muramyl dipeptide，MDP)能够被细胞内信号蛋白NOD2 或cryopyrin炎症体识别而引发免疫反应。MDP与NOD2结合后可诱导IL-6、TNF-α和MCP-1表达，而cryopyrin炎症体发生寡聚化后促进IL-1β和IL-18成熟[22,23]。

4 天然免疫细胞

天然免疫应答是由多种天然免疫效应细胞参与的早期诱导性应答。参与天然免疫应答的细胞在4～96 h发挥作用，本文重点讨论中性粒细胞、DC、Mφ细胞、肥大细胞、NK细胞、γδ T细胞和固有淋巴样细胞在抗金葡菌感染中的作用。

4.1中性粒细胞 中性粒细胞约占外周血白细胞总数的50%～70%，是最早从血液迁移到炎症部位的吞噬细胞[24]。研究表明，中性粒细胞缺失的小鼠更容易感染金葡菌[25]。慢性肉芽肿病是中性粒细胞功能异常最常见的遗传性疾病，中性粒细胞表面TLR5、TLR9、CD11b、CD18、CD35和趋化因子受体(C-X-C motif chemokine receptor 1，CXCR1)表达水平降低[26]。TLR5的表达降低导致中性粒细胞无法识别细菌鞭毛；CD11b或CD18低表达导致中性粒细胞吞噬金葡菌的功能受损；CXCR1表达降低导致中性粒细胞无法被趋化于感染部位。

中性粒细胞主要通过吞噬、脱颗粒及形成中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)3种方式杀灭入侵病原菌[27-29]。金葡菌感染时，中性粒细胞表面的Fc受体和补体受体被激活，增强抗体和补体介导的吞噬作用，吞噬的金葡菌与中性粒细胞内的颗粒成分形成吞噬小体的数目增多[30]。吞噬小体内的多种颗粒可降解被吞噬的物质，产生多种活性氧基团，包括O2-、H2O2、NO等，作为毒性物质直接杀伤细菌。活化的中性粒细胞颗粒内含髓过氧化物酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶、溶菌酶、防御素、碱性磷酸酶、还原型辅酶Ⅱ、氧化酶、胶原酶、乳铁蛋白等多种蛋白，具有直接杀菌或抑制细菌生长及存活的功能。在细胞质内，钙网蛋白(S100A8/S100A9)通过隔离脓肿内的营养离子Mn2+和Zn2+来抑制细菌生长。NETs是在胞外形成的，主要由DNA、组蛋白、髓过氧化物酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶 G、穿透素、明胶酶等组成，染色质DNA是构成该纤维网状结构的骨架，颗粒蛋白镶嵌于其中，可破坏核膜及细胞膜。NETs的作用是一把双刃剑，适量NETs可捕获、局限、杀灭病原菌，如金葡菌，当严重感染时，如在金葡菌或MRSA感染导致的脓毒症中，NETs产生过量，对机体造成伤害[31-33]。NETs以组蛋白或髓过氧化物酶依赖的方式损伤血管内皮细胞和组织，组蛋白激活TLR2/4-MyD88通路产生更多的促炎因子，引起凝血障碍，诱导血栓形成[34]。在肿瘤微环境中，中性粒细胞可分为N1型和N2型。最新研究表明，N1型中性粒细胞有助于NETs形成，N2型中性粒细胞在吞噬病原菌后更易被巨噬细胞吞噬清除[35，36]。因此，抑制NETs形成、促进中性粒细胞向N2极化、减少N1 产生是治疗金葡菌或MRSA感染导致的重症感染的有效策略。

4.2DC DC是目前所知的抗原提呈功能最强的专职性抗原提呈细胞(APC)，也是激活初始T细胞、诱发适应性免疫应答的始动细胞，在免疫识别、免疫应答和免疫调控中发挥重要作用[37,38]。其他APC如Mφ细胞和B细胞等仅能刺激已活化的T细胞或记忆性T细胞。外周组织中未成熟的DC高表达Fc受体、甘露糖受体和TLR等病原体受体，低表达MHCⅡ类分子、共刺激分子和黏附分子，摄取及吞噬病原体的能力较强而抗原提呈能力较弱。未成熟的DC吞噬病原体后从组织迁移到外周淋巴器官，并分化为成熟的DC启动适应性免疫应答。成熟的DC高表达MHCⅠ和Ⅱ类分子、黏附素和共刺激分子(如CD86、CD80和CD40等)，低表达Fc受体和模式识别受体，因此抗原提呈能力较强而抗原摄取能力较弱。朗格汉斯细胞是位于表皮和胃肠道上皮部位的未成熟DC，在金葡菌导致的皮肤感染中，朗格汉斯细胞能够吞噬金葡菌并发挥抗原加工和提呈等作用[39]。

作为特异性免疫应答的始动者，DC在感染早期可分泌大量细胞因子，如IL-6、TNF-α和IL-12等参与机体免疫调节[38]。IL-12是天然免疫反应中最重要的细胞因子之一，DC通过分泌IL-12促进 CD4+T 辅助细胞的增殖和分化，从而诱导Th1型免疫反应。研究表明，CD11c-DTR转基因小鼠由于DC缺失，导致IL-12分泌受阻。与野生型小鼠相比，CD11c-DTR转基因小鼠金葡菌感染引起的炎症损伤更为严重、死亡率更高，通过将未成熟或成熟DC回输到正常BALB/c小鼠体内，小鼠清除肺部金葡菌能力增强。当腹腔注射外源性IL-12后，DC缺失的小鼠抗金葡菌感染的免疫功能恢复[40]。表明DC可能通过产生IL-12调节天然免疫和适应性免疫反应，抵抗金葡菌感染。CD40L是由活化的血小板分泌的趋化因子，具有促进DC吞噬MRSA和成熟等功能[41]。

4.3Mφ细胞 Mφ细胞是专职性APC，具有强大的吞噬功能，广泛分布于各组织中，其形态和功能由所处的组织部位决定。最新研究发现组织定居Mφ细胞最初起源于胚胎中的卵黄囊[42]。在稳态条件下，定居于肺泡、脑、肝脏和表皮等组织的Mφ细胞能够自我更新而不需要循环中单核细胞的补给；在炎症条件下，血液循环中的单核细胞被招募进入组织，并分化为具有组织特异性功能的Mφ细胞，称为招募的Mφ或炎症Mφ细胞[43]。Mφ细胞能够识别、吞噬并清除侵入机体的病原体，并将抗原提呈给周围和淋巴器官的T细胞，诱发适应性免疫应答。

Mφ细胞在金葡菌感染中发挥重要的免疫防御作用。在小鼠流感病毒感染后的肺炎模型中，通过GM-CSF介导的肺泡Mφ细胞大量涌入有利于机体抵抗继发的金葡菌感染，其机制主要通过增加肺泡Mφ细胞产生的活性氧实现[44]。金葡菌细胞壁的成分PGN或LTA刺激Mφ细胞产生IL-33[45]。IL-33通过促进中性粒细胞的增殖、募集吞噬并杀伤金葡菌[46]。此外，IL-33通过与其受体ST2结合从而激活Akt-catenin通路促进NO释放杀菌[47]。金葡菌细胞壁成分脂蛋白也能够通过激活巨噬细胞TLR2受体增加NO分泌，早期NO的释放能够有效地保护机体免于金葡菌感染[48]。TNF-α和IL-6是前炎症因子的典型代表，前期的炎症反应有利于机体控制感染的扩散。在TLR2被阻断的小鼠原代腹腔巨噬细胞中，金葡菌诱导TNF-α、IL-6和IFN-γ产生受阻[49]。

Mφ细胞具有强的可塑性，在体外不同的微环境下可分化为M1型和M2型[50]。M1型又称经典活化的Mφ细胞，分泌TNF-α、IL-1、IL-12和NO等促炎症细胞因子，具有较强的抗原提呈和杀菌能力，在炎症早期发挥主要作用，但大量炎症因子的产生也会引发“细胞因子风暴”，损坏机体正常组织；M2型被称为替代活化的Mφ细胞，分泌IL-10和TGF-β等抑炎性细胞因子,参与组织修复和伤口愈合，在炎症恢复阶段发挥重要作用[51]。因此，在金葡菌或MRSA感染导致的脓毒症早期，促进M1向M2转化，对脓毒症小鼠具有保护作用[52]。

4.4肥大细胞 肥大细胞是皮肤和黏膜的重要哨兵细胞，主要参与IgE介导的超敏反应，同时也参与宿主抗感染免疫应答。当机体被细菌感染时，肥大细胞可通过胞吞作用直接杀灭入侵的病原体，还能通过直接识别病原微生物及其产物参与机体防御反应。肥大细胞最大的特点是能够在胞浆中储存大量TNF-α，因此TNF-α的快速释放是肥大细胞激活的标志。金葡菌感染机体后，肥大细胞通过脱颗粒释放TNF-α，并通过上调血管细胞间黏附分子1和E选择素募集中性粒细胞和DC，前者能够直接杀伤金葡菌，后者在启动适应性免疫应答中发挥重要作用[53,54]。

4.5NK细胞 NK细胞通过与Mφ细胞或中性粒细胞的相互作用参与机体抗金葡菌感染的天然免疫。研究表明，NK细胞与肺泡Mφ细胞的相互作用有利于Mφ细胞对金葡菌的吞噬及清除[55]。金葡菌感染时，NK细胞分泌的IL-22和IL-17等细胞因子有利于机体控制感染。IL-22是IL-10家族成员之一，主要由T细胞产生，也可由NK细胞和固有淋巴样细胞产生。IL-22可诱导皮肤炎症部位产生能够抑制金葡菌生长的抗菌蛋白如S100A7和CAP18/LL37[56]。同时，IL-22还可通过活化STAT3信号通路，促进具有抑制金葡菌增殖功能的蛋白SLURP1表达[57]。IL-17主要由T细胞分泌，也可由NK细胞、γδ T细胞和固有淋巴样细胞等分泌，在金葡菌感染时IL-17也能募集中性粒细胞到达炎症部位[58]。

4.6γδ T细胞 γδ T细胞作为参与天然免疫的T细胞群体，占外周血成熟T细胞的5%～10%，主要分布于黏膜和皮下组织，具有免疫监视和免疫调节等功能，是联系天然免疫和适应性免疫的桥梁。尽管γδ T细胞仅占天然免疫细胞中的小部分，但其在抗金葡菌感染过程中的作用不容忽视。最新的研究进一步证实Vγ6+Vδ4+T细胞是金葡菌感染过程中具有免疫保护作用的主要γδ T细胞亚群[59]。在金葡菌皮肤感染小鼠模型中，感染部位有大量γδ T细胞聚集[60,61]。γδ T细胞通过产生大量IL-17，诱导中性粒细胞的募集和促炎症细胞因子如IL-1和TNF的释放[58]。与野生型小鼠相比，γδ T细胞缺失的金葡菌感染的小鼠中性粒细胞募集受到抑制，局部组织损伤更为严重，细菌荷载量更高[62]。

4.7ILC ILC是来源于共同淋巴祖细胞、具有天然免疫细胞特征的淋巴细胞。ILC可分为3个亚类：ILC1、ILC2 和ILC3。ILC1和ILC2主要分布于肝脏和肠道等部位，在抗病毒、胞内菌和寄生虫感染过程中发挥重要作用[63]。ILC3主要分布于扁桃体及肠道固有层，在抗细菌感染中发挥重要作用，可分泌IL-22和IL-17等细胞因子[64]。提示ILC3可能通过作用于中性粒细胞发挥抗金葡菌感染作用。

5 总结与展望

机体的物理、化学屏障和天然免疫系统共同组成抵抗外来病原菌入侵的第一道防线。病原菌与宿主在免疫细胞水平的相互作用是其致病的重要环节。在金葡菌感染过程中，天然免疫细胞在病原菌的吞噬、识别及清除过程中起关键作用。天然免疫细胞通过PRRs对金葡菌的PAMPs进行识别，进而激活相关信号通路，产生多种细胞因子(如TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-17、IL-22和IL-33等)和趋化因子(如MCP-1、MIP-2等)，招募、激活、趋化多种免疫效应细胞，如中性粒细胞、Mφ细胞和DC等诱导天然免疫应答。同时，吞噬了金葡菌的DC迁移至淋巴结并启动适应性免疫反应。此外，在抗感染过程中，Mφ细胞发挥抗原提呈作用。宿主对病原体的成功防御是快速的天然免疫反应及适应性免疫反应的共同结果。

宿主在抵抗病原菌入侵过程中产生大量促炎症细胞因子，适当的细胞因子合成和分泌对于宿主的免疫防御来说是必要的，但是过度的炎症反应会导致SIRS，甚至引起多器官功能障碍，最终导致死亡。HDT旨在减少感染过程中过度的炎症反应，在病灶部位平衡机体的免疫反应，从而对机体起保护作用。近年中药及其有效成分在抗金葡菌感染方面展现出独特优势，如中药麻黄的有效成分-盐酸麻黄碱(ephedrine hydrochloride，EH)具有良好的免疫调节作用。在金葡菌感染导致的急性腹膜炎小鼠模型中，EH通过促进抗炎因子IL-10分泌和抑制促炎因子TNF-α的表达，减轻肝脏和肾脏病理损伤，提高小鼠存活率[21,65]。台湾含笑的倍半萜内酯类化合物-含笑内酯(micheliolide，MCL)可下调MRSA感染小鼠血清中IL-6、TNF-α、MCP-1和IFN-γ等炎症因子分泌，减轻肝、肾组织病理损伤，降低小鼠死亡率[66]。因此，从HDT角度出发，调控宿主的免疫反应，为抗金葡菌可甚至是耐药菌感染提供新思路。