弓形虫主要分泌蛋白及其功能的研究进展

柳方远，李双星，印春生，单 虎，才学鹏，刘业兵

（1.中国兽医药品监察所，北京 10081；2.青岛农业大学动物医学院，青岛 266109）

弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性细胞内寄生的机会性致病原虫，哺乳动物、鸟类、人都是它的中间宿主。弓形虫不仅能够感染健康人群，对免疫功能缺陷的个体造成严重损伤，还可以感染多种陆生动物，引起母畜流产，是危害严重的人兽共患寄生虫病。弓形虫作为胞内寄生虫，入侵宿主的过程是由多种分泌蛋白介导完成的。弓形虫分泌蛋白通过调控宿主的免疫反应，保证虫体的生长发育，从而维持宿主与虫体之间复杂的平衡机制。这些分泌蛋白主要来自弓形虫顶端复合体的微线体（microneme，MIC）、棒状体（rhoptry，ROP）和致密颗粒（dense granule，GRA）3种分泌型细胞器。

弓形虫入侵宿主细胞早期，微线体蛋白（microneme proteins，MICs）最先从速殖子顶端分泌，识别、附着宿主细胞膜。随后棒状体蛋白（rhoptry proteins，ROPs）释放，与MICs相互作用入侵宿主细胞，形成纳虫空泡（parasitophorous vacuole，PV）。最后，致密颗粒蛋白（dense granule proteins，GRAs）开始分泌，修饰PV，便于虫体获取生存和复制所需的营养[1]。弓形虫的致病机制复杂，分泌蛋白在弓形虫与宿主细胞的相互作用中发挥着重要作用。本文综述了弓形虫主要分泌蛋白生物学功能的研究进展，旨在为研究弓形虫致病机理和疫苗研制提供思路。

1 棒状体蛋白（ROP）

棒状体是位于弓形虫顶端的一种棒状细胞器，依据棒状体蛋白在棒状体细胞器的不同定位，将其分为棒状体基部蛋白（ROPs）和棒状体颈部蛋白（rhoptry neck proteins，RONs）两类。ROPs陆续发现了50余种，是弓形虫特异性的棒状蛋白激酶，在虫体入侵及宿主细胞增殖方面发挥调控作用，对纳虫泡膜（parasitophorous vacuole membrane，PVM）和纳虫泡网状结构（parasitophorous vacuole network，PVN）的形成和维持具有重要作用[2]。ROPs代表成员包括ROP1、ROP2、ROP3、ROP4、ROP5、ROP7、ROP8、ROP16、ROP18等蛋白。RONs囊括RON1-10，分泌至虫体膜和宿主细胞膜之间，与弓形虫的入侵、运动连接（moving junction，MJ）的形成有关，代表成员有RON1、RON2、RON3、RON4、RON5、RON6、RON8等[3]。

1.1 ROP1ROP1是弓形虫特有的一种可溶性分泌抗原。作为穿透宿主细胞的增强因子，ROP1能与其他蛋白形成复合体，影响弓形虫对宿主细胞的黏附，参与虫体入侵宿主细胞。ROP1在弓形虫早期诊断中具有应用价值，是开发弓形虫病疫苗的潜在候选抗原之一，Sonaimuthu等[4]研究表明，利用ROP1构建的重组疫苗能使小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫。

1.2 ROP2ROP2在弓形虫的速殖子、缓殖子和子孢子期均有表达。当弓形虫入侵宿主细胞时，ROP2分泌至PVM，其羧基端的跨膜结构整合至PVM氨基端，其结构域在宿主细胞胞质中起着联系宿主细胞和PV的作用[5]。ROP2还可结合乳铁蛋白，在虫体分裂增殖、棒状体蛋白产生、入侵宿主细胞等过程中发挥着关键作用。此外，ROP2介导细胞免疫反应，促进γ-干扰素等细胞因子的产生，影响虫体增殖[6]。重组ROP2应用于弓形虫病IgA、IgM和IgG抗体的检测，在急性感染和先天性弓形虫病的血清学诊断中具有重要作用。ROP2是弓形虫疫苗较重要的候选抗原之一，Wang等[7]研究表明，重组ROP2可以使小鼠产生强烈的体液免疫和细胞免疫反应，并明显延长小鼠的存活时间。

1.3 ROP4ROP4蛋白序列有2个疏水区，具有前体蛋白和成熟蛋白两种形式，是调节宿主细胞蛋白质磷酸化的重要靶蛋白。ROP4分泌后能迅速整合到PV中，参与并调节PV的形成。ROP4也可结合乳铁蛋白，与宿主细胞的黏附、入侵和细胞内的复制等方面密切相关。ROP4与其他蛋白构成重组嵌合蛋白免疫小鼠后，产生高水平的特异性抗体，引起强烈的体液免疫和细胞免疫反应，是弓形虫病的多抗原疫苗候选分子[8]。

1.4 ROP5由于ROP5蛋白的生物合成过程中没有经过加工和修饰，因此它是一类具有酶折叠结构但没有酶活性的假性激酶。ROP5的合成是发生在虫体入侵宿主细胞和形成PVM的过程中，ROP5直接与PVM相互作用，使宿主细胞重要的免疫应答分子失调。ROP5是弓形虫入侵宿主细胞的一个重要毒力因子，通过抑制巨噬细胞内γ干扰素（IFN-γ）的调节作用来控制弓形虫的毒力[9]。ROP5是ROP18发挥催化活性所必需的效应物，ROP18和ROP5、ROP17形成复合物磷酸化免疫相关GTP酶（immunityrelated GTPases，IRGs），使IRGs不能富集于PVM，进而控制弓形虫的急性毒力作用，保护弓形虫免被清除[10]。目前，ROP5主要应用于弓形虫DNA疫苗的研究。

1.5 ROP13ROP13是可溶性棒状体蛋白，无可识别域，与目前已知的ROPs无任何同源性。ROP13分泌后到达宿主的细胞质，不参与PV的形成，其大量表达能够破环宿主细胞的功能。将重组ROP13免疫小鼠后，引起小鼠体内血清抗体水平升高，产生强烈的细胞免疫反应[11]。

1.6 ROP16ROP16是一种具有酪氨酸激酶活性的可溶性蛋白，由顶端复合体释放，进入宿主细胞后借助核定位结构（nuclear localization sequence，NLS）转运到宿主细胞核，影响宿主基因的表达，并参与宿主细胞内信号转导和转录激活因子（activate signal transducer and activator of transcription，STAT）的相关磷酸化。ROP16可调控STAT3和STAT6信号通路，通过激活STAT3和STAT6，促进白细胞介素12（interleukin 12，IL-12）的释放，参与调节宿主的免疫应答[12]。ROP16是弓形虫的重要毒力因子，依靠调控因子IFN-γ诱导NO的生成，调控宿主对弓形虫的抑制作用，ROP16还可以通过基于脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的细胞因子的合成，参与调控宿主细胞[13]。目前，ROP16广泛应用于弓形虫疫苗的研究。

1.7 ROP18ROP18蛋白是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，定位于PVM，是弓形虫毒力相关基因，其毒力随着表达量的增加而增加。ROP18作用的发挥与IRGs、转录激活因子ATF6β（activating transcription factor，ATF）和P65（protein 65）等密切相关[14]。ROP18通过识别并清除宿主细胞内的IRGs，保护PVM不被免疫细胞清除。ROP18通过调节ATF6β，诱导ROP18的毒力作用，从而抑制宿主的免疫应答，逃避巨噬细胞的吞噬作用。Du等[15]的研究发现，ROP18通过促进P65的降解来抑制宿主的NF-κB信号通路。目前已发现多种ROP18的宿主互作因子，包括：Irgb6、Irgb10、Irga6和ATF6β等，这些互作因子积极参与虫体对宿主细胞的黏附、蛋白降解、DNA修复、转录调控及翻译后修饰等过程。目前，ROP18主要应用于弓形虫疫苗的研究，是重要的疫苗候选分子，带有ROP18基因的载体疫苗在未来疫苗研发中具有巨大的潜力。

1.8 ROP38ROP38定位于PVM，是近年来新发现的一种活性激酶，是一种重要的调节蛋白，宿主细胞的1000多种基因表达都与它有关。ROP38在不同基因型的虫株中表达量有显著差异。ROP38通过调控宿主细胞有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPK）信号通路，参与宿主信号通路、细胞增殖和凋亡等过程[16]。ROP38主要应用于弓形虫DNA疫苗的研究。

1.9 ROP46ROP46是一种蛋白激酶，当弓形虫从速殖子转化为缓殖子时，ROP46的表达量明显升高。ROP46是弓形虫从速殖子向缓殖子转化过程中的关键蛋白，与弓形虫入侵宿主细胞和调节毒力有密切关系。ROP46可能参与PVM的形成和修饰过程[17]。

1.10 RONsRONs与ROPs相比较为保守，RONs分泌后靶向定位于宿主细胞质膜。在弓形虫入侵宿主细胞的过程中，RONs最先释放，以响应MICs触发的入侵信号。RONs参与MJ的形成，该结构由RON2、4、5、8形成的大分子复合物及顶膜抗原1（apical membrane antigen 1，AMA1）构成[18]。MJ的主要功能是建立弓形虫与宿主细胞之间的连接，使弓形虫进入宿主细胞。研究表明，RON9和RON10形成的复合物不出现于MJ结构中，目前关于RONs迁移形成MJ结构的具体机制仍不清楚。RON2在结构功能上将虫体与宿主细胞串联起来，对于虫体入侵至关重要，是重要的疫苗候选分子[19]。RON4定位在移动复合体，已经证实是磷酸蛋白，具有激酶和磷酸酶的潜在功能。

2 微线体（MIC）蛋白

微线体蛋白分泌释放到虫体顶端或表面，参与弓形虫的滑行运动和入侵宿主细胞。微线体蛋白由多种跨膜蛋白和黏附蛋白组成，目前，已知至少20余种，包括MICs、菱形体蛋白酶（rhomboid protease，ROMs）、AMA1、MIC2相关蛋白（microneme proteinⅡassociated protein，M2AP）、穿孔素样蛋白1（perforin-like protein 1，PLP1）、解毒素4（toxolysin 4，TLN4）、枯草杆菌蛋白酶1（subtilisin 1，SUB1）、改变血小板反应素重复域的子孢子蛋白（the sporozoite protein with an altered thrombospondin repeat，SPATR）等[20]。MICs具有黏附结构域，可以结合宿主细胞表面受体和糖类，形成与宿主细胞受体相互作用的复合物，分泌到弓形虫的表面，在弓形虫毒力和致病性方面发挥了重要的作用。

2.1 MIC1MIC1无跨膜区，属于可溶性蛋白。MIC1具有凝集素特性，可能参与虫体与宿主细胞表面结合过程。MIC1蛋白含有两个微线体黏合重复域（microneme adhesive repeat，MAR）和两个血小板结合蛋白（thrombospondin，TSP）样结构，MAR与唾液酸寡糖结合后，参与弓形虫入侵宿主细胞的过程。MIC1与MIC4、MIC6相连，组成MIC1-MIC4-MIC6复合体。当前，MIC1主要应用于弓形虫诊断。

2.2 MIC2MIC2的氨基酸结构中含有I或A结构域和6个TSP样结构，与虫体识别宿主细胞的黏多糖有关系。MIC2与其同源蛋白质血小板反应蛋白相关匿名蛋白（thrombospondin related anonymous proteins，TRAP）具有相同的结构域，而TRAP能够驱动疟原虫进行滑翔运动和入侵红细胞，因此，MIC2可能参与弓形虫的滑翔运动和入侵过程[21]。MIC2和M2AP以1∶1的比例形成MIC2-M2AP六聚复合体，在弓形虫入侵宿主细胞的过程中发挥重要作用。MIC2在虫体的各期均有表达，是弓形虫感染的主要毒力因子，目前关于MIC2的应用研究主要致力于构建MIC2缺陷株，开发有效弱毒活疫苗。

2.3 MIC3MIC3由微线体分泌，经虫体修饰后以二聚体的形式存在，是重要的黏附分子，参与虫体对宿主细胞的识别、黏附及入侵过程。MIC3在虫体各个时期均能表达，该蛋白质在护航蛋白MIC8的保护作用下分泌至细胞外膜[22]。MIC3含5个表皮生长因子样结构域（epithelial growth factor-like domain，EGF-like domain）和1个几丁质连接样结构域（chitin binding-like domain，CBL）。EGF有助于MIC3形成正确的空间结构，在MIC3和MIC8形成复合体的过程中起重要作用。CBL参与MIC3对宿主细胞的黏附，可能与蛋白质间及碳水化合物间的相互作用有关。目前已有利用MIC3研制核酸疫苗和活载体疫苗的报道，该蛋白是在弓形虫病诊断和疫苗研制中非常有前景的候选分子[23]。

2.4 MIC4MIC4无跨膜区，含有6个苹果结构域（apple motif），其C端的App6结构具有黏附功能。MIC4在弓形虫的所有感染阶段都有表达，参与虫体对宿主细胞的黏附过程、蛋白水解和血液凝固过程，MIC4和MIC1、MIC6组成复合体[24]。MIC4可以作为弓形虫感染诊断的候选分子。

2.5 MIC5-9MIC5不含黏附结构，参与MIC2-M2AP复合体的运输过程，在弓形虫黏附于宿主细胞表面的过程中起间接相关的作用。MIC6在弓形虫速殖子期表达，作为跨膜蛋白携带MIC1和MIC4到达微线体，在微线体中形成MIC1-MIC4-MIC6复合体。MIC7结构中含有内含子，在弓形虫包囊内表达。MIC8在弓形虫的速殖子和缓殖子期均有表达。MIC9氨基酸结构中含有EGF样域，主要在裂殖子期表达[25]。

2.6 MIC10MIC10为小分子蛋白，无跨膜区，不含有黏附结构。MIC10在速殖子期的表达量是缓殖子期的3倍，因此检测MIC10有利于区分急性和隐性感染。MIC10不参与宿主细胞的配体受体作用，该蛋白可能在虫体入侵时进入到组织中，作为一种循环抗原被检测到[26]。MIC10可作为高敏感性弓形虫感染诊断方法检测的靶标，重组MIC10蛋白及其特异性抗体可作为检测试剂用于建立检测患者体内弓形虫天然抗原或抗体方法。

2.7 其他微线体蛋白AMA1参与弓形虫自身的复制。弓形虫入侵细胞时，AMA1分泌到弓形虫表面与RON2结合形成移动连接，参与弓形虫的入侵过程。AMA1免疫能促进IFN-γ的产生，比MIC2、M2AP基因免疫有更好的保护效果[27]。MIC11位于微线体前端，属于钙离子依赖性蛋白，具有在成熟之前移除内部前肽的特性，MIC11在速殖子和缓殖子中表达[28]。MIC6、MIC8、AMA1和MIC16都能与醛缩酶相互作用，对细胞膜的敏感性和转运信号的传导都有重要的作用[29]。

2.8 MIC2-M2AP复合体MIC2与M2AP以1∶1的比例，形成MIC2-M2AP六聚复合体，复合体先转运到高尔基体，再到达微线体。MIC2-M2AP六聚复合体在虫体入侵宿主细胞时外排出虫体，与宿主细胞表面受体结合，参与虫体的滑行运动和快速入侵，在虫体入侵宿主细胞过程中起着重要的作用[30]。

2.9 MIC1-MIC4-MIC6复合体MIC1与MIC4相互作用，使MIC4的App6结合到宿主细胞上。MIC6作为护航蛋白护送MIC1和MIC4到达微线体，使MIC1、MIC4连接在弓形虫表面，形成MIC1-MIC4-MIC6复合体。MIC1-MIC4-MIC6复合体在分泌运输过程中，3种蛋白相互作用，有助于虫体的黏附和入侵。

2.10 MIC3-MIC8复合体MIC3在护航蛋白MIC8的护送下，到达微线体。当弓形虫入侵宿主细胞时，MIC3排出虫体，黏附到宿主细胞表面。MIC3-MIC8复合物与棒状体的分泌密切相关[31]。

3 致密颗粒蛋白（GRA）

GRAs是由致密颗粒细胞器分泌的一类免疫活性蛋白，与虫体在宿主细胞内的存活和营养代谢交换机制相关。GRAs分别从虫体顶端、侧面及末端分泌进入PV，对PV和PVN的形成和维持具有重要作用。GRAs可以抵抗宿主细胞溶酶体的酸化和裂解，抵抗宿主细胞对弓形虫的攻击，确保弓形虫在细胞内的生存。GRAs在宿主体内具有较好的免疫原性，是宿主感染后血液循环抗原的重要组成部分[32]。目前已发现的GRAs有50余种，包括GRA1-17、GRA23-25、GRA39、组织蛋白酶（cathepsins，CPC）、三磷酸核苷酸水解酶（nucleoside triphosphate hydrolase，NTPase）、蛋白酶抑制剂（protease inhibitors，PI）、STAT1 转录活性抑制因子（inhibitor of STAT1 transcriptional activity，IST）、Myc调节因子（Myc regulation，MYR）等。

3.1 GRA1GRA1（P24），为分泌型可溶性蛋白，是弓形虫分泌排泄抗原（excretory secreting antigens，ESAs）的重要组成成份之一。GRA1有两个钙离子结合区域，可作为缓冲分子参与虫体内钙离子的摄入与释放。GRA1可分泌到PV空间管状囊泡结构的外围，激活和稳定PVN结构，在修饰调节PV结构中起重要作用。GRA1在速殖子和缓殖子期均能表达，与弓形虫速殖子侵入宿主细胞的信号转导有关，可作为致密颗粒蛋白的标记基因[33]。GRA1应用于弓形虫感染诊断，具有较好的免疫原性，可作为疫苗的候选分子。

3.2 GRA2GRA2（P28），是弓形虫毒力相关基因，在弓形虫入侵宿主细胞后，GRA2分泌到PV，诱导PVM表面网络的形成[34]。GRA2可与GRA4、GRA6在PVM上结合并形成一个多聚复合体，参与PV蛋白质以及营养物质的转运[35]。GRA2在速殖子和缓殖子期均可表达，是潜在的抗原标记物。GRA2可应用于人和动物弓形虫诊断，GRA2在弓形虫感染早期阶段检测中具有较高的敏感性，能够用于研发检测弓形虫的胶体金免疫层析试纸条，是弓形虫疫苗研制的候选分子。

3.3 GRA3GRA3位于PVM，无跨膜结构域，其N端的信号肽序列和跨膜区使GRA3以低聚物聚合，嵌入PV的脂质双分子层，参与PVM的形成。GRA3在弓形虫入侵宿主细胞后发挥着重要的作用，在虫体内具有较高的转录水平。GRA3主要在速殖子期表达，可能是虫体复制的一个前提条件[36]。

3.4 GRA4GRA4同GRA1、GRA2一样存在于PV的网状结构中。在PV形成初期，GRA4分布于PV中，通过蛋白间相互作用及疏水作用与GRA2和GRA6形成复合物稳定PVN，确保细胞营养物质进入PV[37]。GRA4有较强的抗原性，可以引起机体产生多种抗体，诱导机体产生保护性免疫。GRA4能与弓形虫IgA、IgM、IgG等抗体发生免疫反应，主要应用于弓形虫病的诊断及疫苗研究。

3.5 GRA5GRA5（P21），存在于弓形虫的所有生命阶段，为可溶性蛋白和疏水性聚合物。GRA5与GRA3相似，都定位于PVM，这两个蛋白可与宿主细胞内质网的钙离子调节配体（Calcium modulating ligand，CAMLG）结合，使PV和宿主细胞内质网相连[38]。当弓形虫入侵宿主细胞时，可溶性的跨膜蛋白GRA5分泌到PV，维持PV的结构稳定并参与入侵宿主细胞。GRA5在多种抗原联合诊断中是一个很好的补充抗原，是弓形虫疫苗研制的候选分子。

3.6 GRA6GRA6定位于PV，为单拷贝基因，其C端具有多态性，可以通过钙调节配体激活T细胞核因子4（nuclear factor of activated T cells，NFAT），导致宿主选择性诱导免疫调控基因或细胞因子，使趋化因子的合成量升高，招募炎性细胞到达弓形虫感染部位，产生免疫应答[39]。GRA6通常用来检测孕妇血清中的弓形虫IgG抗体滴度，区分弓形虫急性感染和慢性感染。

3.7 GRA7GRA7（P29）是一种酸性可溶性蛋白。GRA7是目前发现的唯一一个将虫体膜与宿主细胞膜连接的膜内在蛋白质。GRA7定位于速殖子的PVN和PVM。GRA7与纳虫泡的结构形成相关，可免除宿主细胞器对虫体的内吞作用。GRA7具有较高的抗原性，是弓形虫毒力相关因子，免疫GRA7蛋白可诱导机体产生免疫反应，对于触发巨噬细胞的肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）机制和诱导NF-κB的活化具有至关重要的作用[40]。Alaganan等[41]研究发现，在弓形虫入侵过程中，GRA7与ROP2、ROP8、ROP18能形成复合体作用于GTPases。GRA7常用作诊断弓形虫急慢性感染的工具，是弓形虫疫苗的候选分子之一，已有学者将GRA7蛋白衍生的限制性表位组装成纳米球，制备纳米疫苗制剂，增强了源自弓形虫虫体抗原的免疫原性[42]。

3.8 GRA15GRA15是一种多态性分泌蛋白，主要在弓形虫速殖子期表达。GRA15可与TRAF6互相作用，激活NF-κB信号通路，诱导IL-12分泌，进而激发细胞凋亡、免疫反应和炎症反应等信号[43]。在弓形虫入侵时，GRA15能够诱导CD8+T淋巴细胞介导的免疫效应。Chen等[44]将GRA15与其他抗原联合免疫小鼠，发现联合免疫可以引发小鼠细胞免疫和体液免疫反应，提高保护效率。

3.9 GRA16GRA16与弓形虫的致病性相关。GRA16通过与宿主泛素特异性蛋白酶（ubiquitin-specific protease，HAUSP）和蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）的相互作用进入宿主细胞核，调节肿瘤抑制因子P53的水平，进而调控宿主细胞的转录功能，包括调节宿主细胞代谢和细胞周期等[45]。

3.10 GRA24,25 GRA24与GRA16结构相似，能越过PVM到达宿主细胞胞质中。GRA24与宿主的p38αMAPK结合形成复合物，在宿主细胞核内发挥作用，参与调节细胞因子，促使单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）和IL-12的产生，具有调节宿主细胞转录的功能[46]。GRA25是与弓形虫毒力相关的分泌蛋白。GRA25含有8个B细胞抗原表位，影响宿主巨噬细胞分泌炎性趋化因子CCL2和CXCL1，从而影响免疫应答[47]。

3.11 其他致密颗粒蛋白IST能抑制STAT1依赖的干扰素反应，IST可以直接进入宿主细胞核，改变染色质环境，阻止干扰素反应的发生，从而减少宿主细胞免疫反应对PV的破坏[48]。PI参与弓形虫入侵宿主细胞的过程，对糜蛋白酶、胰蛋白酶、中性白细胞弹性蛋白酶具有特异性抑制作用，PI在先天性免疫中发挥调节作用[49]。GRA17和GRA23可以在PVM形成微孔，介导小分子物质在PVM中的转运，弓形虫可以通过这种方式获取宿主细胞的营养物质，同时保持PVM的稳定性。GRA22可以调节钙离子浓度，参与调控虫体在宿主细胞内的逸出[50]。MYR1定位于PV和PVM，参与弓形虫分泌蛋白由PV转运到宿主细胞胞质的过程，可作为一种中心调控蛋白参与调节虫体GRAs。MYR1、MYR2和MYR3都能影响GRA24的运输。GRA39具有通过脂质调控来影响虫体生长的重要作用。GRA41参与调节钙离子和酰基转移酶（cholesterol acyltransferase，LCAT）的催化活性，维持虫体内部环境的脂质代谢平衡[51]。

4 小结与展望

近几年来，研究人员对弓形虫的多种蛋白都做了大量研究，已经报道了数种弓形虫蛋白质的功能和特性，使我们从蛋白质层面全面认识弓形虫的致病机制，并研制了多种弓形虫疫苗，但其免疫效果都不十分理想。因此，对弓形虫蛋白质组分和功能的探索、免疫学特性、新抗原的鉴定评估等都亟需更深入的研究。目前，在弓形虫疫苗研究方面，大多数具有免疫原性的分泌蛋白都可用于亚单位疫苗的研究；ROP5、ROP16、ROP18、ROP38、ROP54、MIC3、MIC6等蛋白常见于DNA疫苗的研究；ROP2、ROP18、GRA6、AMA1等蛋白可用来研究RNA疫苗[52]。MIC1、MIC10、GRA1、GRA2、GRA4、GRA6等常应用于弓形虫感染的诊断。

弓形虫依赖不同的分泌蛋白协助虫体完成整个胞内生长周期，在入侵宿主细胞过程中，参与宿主的免疫应答，弓形虫分泌蛋白在虫体生长发育和免疫逃避过程中扮演着重要角色。分泌蛋白在虫体不同阶段内的表达和发挥作用不同，通过上文可知，ROP13、ROP18、RON2、GRA24在弓形虫某一阶段的表达具有较强的致病性和免疫原性；ROP5、ROP8、ROP16、ROP38、ROP48、RON4、MIC1、MIC5、GRA2、GRA4、GRA10、GRA12、GRA15、GRA16在弓形虫速殖子和缓殖子阶段均表达；而ROP2、MIC3、MIC4、MIC13、GRA1、GRA6、GRA8在弓形虫三个阶段均表达。ROP5、ROP17、ROP18能形成复合物保护弓形虫免于被清除；微线体蛋白相互结合形成复合体，参与虫体生长发育和入侵宿主细胞；GRA7与ROP2、ROP8、ROP18形成复合体，作用于免疫相关的GTPases。因此，筛选在弓形虫多个阶段表达且具有高致病性和免疫原性的关键蛋白作为候选抗原，以及研究蛋白之间的互作，开发包含多种抗原的疫苗或联合疫苗是今后弓形虫疫苗研制的两条重要思路。

随着研究的发展，ROPs、MICs、GRAs家族成员被一一揭示，许多新型蛋白被成功鉴定，比如ROP54、ROMs、GRA35、GRA39、GRA41、GRA42、GRA43等，但是对于这些新型分泌蛋白在虫体发育阶段的迁移、入侵、复制和免疫逃避等机制中的功能和角色我们还尚不清楚，这些都值得我们进行探索，对了解弓形虫的致病机制、抗原特性、诱导宿主产生免疫应答及免疫保护等方面均具重要价值。