榆树枯枝病病原菌的形态学鉴定

祝文博，刘建荣，王永， 彭徐剑，刘雪峰*

(1.东北林业大学 林学院，哈尔滨 150040； 2.黑龙江省塔河林业局林管理处森防站，黑龙江 塔河 165200； 3.南京森林警察学院，南京 210023)

0 引言

榆树(UlmuspumilaL.)隶属榆科 (Ulmaceae) 榆属 (UlmusL.) 植物。又称榆、白榆、榆树。分布于东北、华北、西北及西南各省区。生于海拔1 000～2 500 m的山坡、山谷、川地、丘陵及沙岗等处。长江下游各省有栽培, 也为华北及淮北平原农村的习见树木。朝鲜、苏联和蒙古也有分布[1]。榆树木质坚硬，纹理清晰通直，花纹美丽，稍耐腐，是很好的建筑、家具和农具材料。果、树皮、叶和根可入药，能安神、利尿，可治神经衰弱、失眠及浮肿等症。种子含油，可供食用和制肥皂[2]。同时榆树因其生长迅速、繁殖力强和适应性广，既耐寒冷、干旱、瘠薄，又耐盐碱[3]，且榆树树干通直，树形高大，适应性强，生长快，是城市绿化、行道树、庭荫树、厂绿化以及营造防护林的重要树种[4-5]。目前榆树主要病害包括榆树黑斑病、榆树溃疡病和榆树红疣枯枝病等[6-9]。这些病害常发生在苗圃、人工林、次生林、天然林和绿化园林树木上。最终造成枯枝病状,严重时可使病树致死,此病是一种潜伏侵染性病害[10-12]。

本文研究的是在东北林业大学校园内发现的榆树枯枝病，经鉴定是由火炬树暗葡腔菌(Phaeobotryonrhois)引起的，是危害榆树的新病害。该病害主要危害一年到两年生的下部枝条，且危害严重，导致大部分枝条枯死。经调查下部枝条发病率约有20%，与此同时该种病害常与榆紫金花虫伴随发生，一旦榆树被榆柴金花虫虫害加重，导致榆树抵抗力减弱，病原菌火炬树暗葡腔菌(Phaeobotronrhois)向上蔓延危害榆树幼树主干，致使榆树全株枯死(图1)。基于此，本文对该病害的症状和病原菌形态学及分子鉴定，以期为生产单位防治该病提供参考。

Phaeobotryon由Theissen&Sydow(1915)建立，根据形态特征被认为与Botryosphaeria是相近的。von Arx&Müller[13-14]认为Phaeobotryon与Botryosphaeria为同属异名。然而，最近的研究表明，Phaeobotryon在形态上和系统发育上与Botryosphaeria存在很大差异，所以这两个属是明确的独立的属[15-16]。火炬树暗葡腔菌(Phaeobotryonrhois)可以寄生在不同种木本植物上引起植物枯枝病。而在榆树上发现的则是由火炬树暗葡腔菌(Phaeobotryonrhois)引起的一种榆树上的新病害。

图1 野外榆树枯枝病病枝Fig.1 The branch wilt pathogen of Ulmus pumila L.

注：A、B.野外发病榆树枝；C、D.野外枯死的榆树侧枝。

Note: A、B. DiseasedUlmuspumilaL. branches in the wild; C，D. WitheredUlmuspumilaL. branches in the wild.

1 材料与方法

1.1 材料

2019年4月，从东北林业大学校园内观察到榆树枯枝病病害枝条，采集具有典型病症的标本用纸质信封密封包好带回实验室，进行病原菌观察及病原菌分离。

1.2 方法

1.2.1 榆树枯枝病病原菌分离培养

用75%的酒精棉擦拭发病榆树枝条表面，用无菌刀切取榆树发病枝条上带有分生孢子器的发病组织为分离材料，在超净工作台下接种于PDA培养基上进行病原菌分离。将接种后的培养皿放入25 ℃的培养箱中恒温培养2 d后，挑取菌落边缘菌丝接种至PDA平板连续纯化3次，并将纯化后的菌种转接到PDA斜面试管中，放置4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 榆树枯枝病的致病性测定

选取健康无病害粗细相等的榆树枝条进行离体水培培养。根据柯赫氏法则定，采取针刺接种、烧伤接种和无伤接种法进行接种试验。在刺伤、烧伤和无伤处理的榆树枝条上覆盖直径7 mm的PDA培养基上培养的该病害菌饼，用浸有无菌水的纱布和嫁接膜保湿培养48 h，重复10组。以针刺、烧伤和无伤接种无菌水做空白对照，各重复10组。将处理后的树枝做好标记室温下培养，观察发病情况。

1.2.3 榆树枝条枯病病原菌形态鉴定

取带有榆树枯枝病病原菌子实体的标本进行切片，制成临时水载片，在光学显微镜下观察分生孢子器、产孢细胞和分生孢子的形态特征及其大小。

1.2.4 榆树枯枝病病原菌分子鉴定

将病原菌菌株接入PDA培养基上，在25 ℃的培养箱中培养7 d，收集菌丝体，选取北京擎科生物有限公司生产的No.TSE0 11 200 rxns快捷型植物基因组 DNA 提取试剂盒(2×T5 Direct PCR Kit (Plant)) ，提取菌丝真菌基因组DNA。

rDNA-ITS区段分析采用通用序列引物ITS1:(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4:(5′-TCCGCTTATTGATATGC-3′)对样品的 rDNA ITS1-ITS4 区域进行扩增。PCR 反应体系，模板 DNA 1μL，引物各1μL，2×T5 Direct PCR Mix (Plant)25μL，灭菌 ddH2O定容至 50 μL。PCR 反应条件为：预热 94 ℃、5 min，变性 94 ℃、30 s，退火 55 ℃、30 s，延伸72 ℃、1 min，补平 72 ℃、10 min;40 个循环。

2 结果与分析

2.1 致病性测定

致病性测定结果表明，烧伤接种病原菌的榆树枝条45 d后在接种的榆树枝条上长出了分生孢子器，其症状表现与野外采集的发病枝上症状相一致，将发病组织中分离的病原菌形态与野生型病原菌形态进行对比，发现其与野生病原菌形态一致。刺伤、无伤接种病原菌和对照组均不发病(表1，图2)。

表1 3种接种方法对榆树离体枝条的接种情况

图2 榆树枯枝病实验室接种图Fig.2 The branch wilt pathogen of Ulmus pumila L. in the laboratory

注：A.烧伤接种；B.刺伤接种；C.烧伤CK；D.刺伤CK；E.无伤CK。

Note: A. Burnt inoculatio; B. Scratch inoculation; C. Burnt CK; D. Scratch CK; E. No injury CK.

2.2 病原菌形态特征

对自然发病的榆树枝条切片在光学显微镜下进行观察，分生孢子器初埋生，成熟后突破树皮外露，黑色，表面扁球形，孢子成熟后从孔口喷出大量分生孢子并附着在树皮表面成黑色。分生孢子器为单腔球形，分生孢子器外径为350～ 450 μm，内径为188～275 μm。器壁黑色至无色，侧面黑色器壁由12～20层细胞组成，无色器壁由6～11层细胞组成；产孢细胞由分生孢子器无色器壁细胞形成。产孢方式为全壁芽生单生式，产孢细胞之间有许多细长的无色丝状菌丝；分生孢子初期单胞、无色、短小、壁薄，成熟的孢子暗色、双胞和分隔处缢缩、孢子近等大、孢子两端钝圆，偶有一端平截、大椭圆形。分生孢子大小为(22.5～27.5)μm ×(10.0～15.0)μm(n=50)(图3)。该病原菌与Fan 等描述的Phaeobotryonrhois形态相似[17]。

图3 榆树枯枝病病原菌形态学特征Fig.3 The morphological characteristics of Phaeobotryon rhois

注： A.分生孢子器外观；B.分生孢子附着在分生孢子器表面；C.分生孢子器纵切面；D.分生孢子器器壁；E.连有孢子的产孢细胞；F.分生孢子。

Note: A. The appearance of Pycnidium; B. Pycnidium with conidia; C. Pycnidium in section; D. Sporophores wall; E. Sporulation cell; F. Conidia.

榆树枯枝病病原菌在PDA培养基上，菌落白色绒毛状，7 d左右菌丝长满平板，菌落颜色开始由白色变成黑色；在黑暗处培养10 d后，见光处理50 d后，培养基上出现分生孢子器，单生，球状，埋生至半埋生，黑色。切片观察其形态特征与野生型病原菌形态特征一致。

2.3 rDNA-ITS序列分析

将提取的病原菌(编号为Y1)rDNA-ITS基因片段测序结果在NCBI上进行BLAST比对，对比结果显示rDNA-ITS 段序列与菌种Phaeobotryonrhois(GenBank ID: MK072615.1)相似度为99.62%。并利用软件MEGA 7 与 BLAST 结果中的近缘菌株构建系统发育树，结果表明该实验中所提取的病原菌Y1与菌种Phaeobotryonrhois在一个分支上，亲缘关系最近，可信度为100 (图4)。

图4 菌株Y1与GenBank中相近菌株的 rDNA-ITS序列系统发育树Fig.4 The phylogenetic tree of rDNA-ITS sequence strain Y1 and similar strains in GenBank

3 结论与讨论

根据柯赫氏法则、病原菌形态特征以及DNA分子比对，证明榆树枯枝病是由火炬树暗葡腔菌(Phaeobotryonrhois)引起的。根据资料记载该菌在自然寄主上产生的分生孢子器大小为180～380 μm (n= 20)，分生孢子大小为(19～25) × (10～12) μm (n= 50) 。比榆树上发现的火炬树暗葡腔菌(Phaeobotryonrhois)的分生孢子器小2.5～3 μm，分生孢子几乎相等。推测这些差异可能与其分布地区以及寄主的差异有关，但依据其主要形态特征及分子生物学鉴定确认此菌为火炬树暗葡腔菌(Phaeobotryonrhois)，为国内榆树新病害。

在我国宁夏回族自治区地区发现了由火炬树暗葡腔菌(Phaeobotryonrhois)引起的火炬树枯枝病[17]。而在哈尔滨地区首次发现寄生在榆树上的火炬树暗葡腔菌(Phaeobotryonrhois)。该种病害主要引起榆树枯枝病，引起榆树枝条的死亡枯萎。通过本文的研究发现，火炬树暗葡腔菌(Phaeobotryonrhois)不是强侵染性病原菌，主要侵染衰弱的榆树枝条。本文中对榆树枯枝病病原菌的鉴定为该病防控提供了依据。