饲料β-胡萝卜素水平对镇海林蛙蝌蚪生长发育的影响

王海燕,樊晓丽,林植华

(1.浙江农林大学动物科技学院，杭州 311300；2.丽水学院生态学院，浙江丽水 323000)

β-胡萝卜素(β-carotene)是一种广泛存在于自然界中的有色物质，作为动物体内的脂溶性抗氧化剂，是动物体内关键调节信号因子，在动物体内具有重要的生物学功能[1-2]。近年来，许多学者研究饲料中添加类胡萝卜素对动物养殖的影响。Horak等[3]研究表明添加10 μg/mL类胡萝卜素，显著增加金翅雀(Carduelischloris)体重。Simons等[4]研究表明鸟类体内类胡萝卜素浓度增加，抗氧化能力显著提高。McCartney等[5]研究表明增加变色蜥蜴幼体(Chamaeleocalyptratus)类胡萝卜摄入量，将促进幼体生长和免疫系统的发展。Pike等[6]研究表明饲料中添加200 μg/g类胡萝卜素提高了三刺鱼(Gasterosteusaculeatus)繁殖能力。因此，β-胡萝卜素在动物养殖中有广阔的应用前景[1]。

镇海林蛙(Ranazhenhaiensis)隶属于两栖纲(Amphibian)无尾目(Anura)，在干旱性季节(1-4 月)进行繁殖，其蝌蚪常见于低洼、沟渠和临时水体[7]，关于镇海林蛙的研究主要集中在生态地理分布[8-9]、毒理学[10]和孵化条件[11]等方面。本研究以镇海林蛙蝌蚪为实验动物，在基础饲料中添加不同浓度的β-胡萝卜素，研究其对镇海林蛙蝌蚪生长性能的影响，确定饲料中β-胡萝卜素的最适添加量，为其在蛙类养殖产业的应用提供一定的基础理论数据，也为蛙类资源的保护、开发和利用提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

2018年12月20日，从丽水学院校园内捞取12窝镇海林蛙卵团，置于人工气候室(温度21 ℃，光周期14 L∶10 D)12个塑料箱(50 cm×30 cm×20 cm，水深8 cm)中，放入曝气水，孵化出膜后发育至Gosner25～26[12](参考Gosner对蝌蚪发育历期的鉴定)，用于后续实验。实验开始前，镇海林蛙蝌蚪的初始体重为(37.12±0.51)mg，体长为(5.66±0.03)mm，尾长为(10.84±0.05)mm。

1.2 实验设计

1.2.1 饲料制备

在基础饲料粉末(黑斑蛙蝌蚪专用饲料，购买于厦门市殷海饲料有限公司，产品分析保证值为粗蛋白含量≥40.0%，粗脂肪≥3.0%，水分≤10.0%，钙≤4.0%，赖氨酸≥2.2%，粗纤维≤6.0%，粗总灰分≤16.0%，总磷≤1.3%，使用粉碎机粉碎后，分别添加β-胡萝卜素粉末(β-胡萝卜素浓度为98%，西安百川生物科技有限公司)混合，通过过筛(50目)20次，混合均匀，密封储存在-4 ℃的冰箱中备用。

1.2.2 试验分组及饲养

2019年1月8日，随机捞取288尾蝌蚪均分到4实验组，每组3个重复，每个重复组24尾蝌蚪(1组：50 mg/kg β-胡萝卜素；2组：500 mg/kg β-胡萝卜素；3组：1 200 mg/kg β-胡萝卜素；4组：基础饲料)[13]。试验饲料中添加β-胡萝卜素的实测浓度为：1组0.005%；2组：0.053%；3组：0.128%；4组不含β-胡萝卜素。整个试验过程，蝌蚪饲养在塑料箱(32 cm× 21 cm×10 cm，水深7 cm)中，置于人工气候室内(温度21 ℃，光周期14 L∶10 D)，每2 d喂养足量饲料粉末(喂至蝌蚪停止进食)。

1.3 镇海林蛙蝌蚪和幼蛙形态测定

在蝌蚪生长1 d和19 d时，每个处理水平的3个重复组，随机挑选4只蝌蚪，用电子分析天平(精确度±0.000 1 g)称取其体重，通过Nikon XTS30解剖显微镜鉴定蝌蚪初期和中期的发育历期[12]，同时测定蝌蚪的体长和尾长[14]。当蝌蚪出现前肢(Gosner 42)时则认定达到变态，并记录每只变态时间。本实验蝌蚪变态时间为40～54 d，蝌蚪的尾部完全消失，即完全变态(Gosner 46)。

将每只完全变态幼蛙捞出，用吸水纸吸干体表水分后，用电子分析天平称取其湿重(±0.000 1 g)，分别用数显游标卡尺(±0.01 mm)测定其体长、头长、前臂及手长和后肢长。

1.4 镇海林蛙幼蛙跳跃距离的测定

将每只完成变态的幼蛙捞出，分别对幼蛙运动表现进行测定。先将幼蛙置于室内(21 ℃)适应10 min，然后将其放入1%的红色食用色素溶液中浸湿四肢，取出置于铺有白色纱布的地面上，使用枝条轻触其尾杆骨来刺激其跳跃，测量跳跃距离(上一个后肢印迹的末端到下一个后肢印迹的末端之间的距离)，每只幼蛙重复5次。用直尺测量出最长三次的跳跃距离(±0.01 cm)，取其平均值。

1.5 幼蛙肝脏酶活测定

从每个塑料箱中分别取4只幼蛙用于总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力和过氧化氢酶(CAT)活力的检测。幼蛙迅速处死后取肝脏组织，进行称重，置于-80 ℃冰箱保存。实验时，取出肝脏样品融化解冻，用预冷任氏液冲洗3次，立即用滤纸吸干其表面水分，按照湿重(g)∶体积(mL)=1∶9的比例加入预冷任氏液，在冰浴中快速剪碎研磨制备10%的肝脏组织匀浆，低速离心10 min(3 000 r/min)，取上清液。用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。T-SOD和CAT活力检测参见试剂盒说明书，实验试剂购买于南京建成生物工程技术研究所。使用紫外分光光度计(UV-2550，日本岛津公司)测定T-SOD活力和CAT活力。

1.6 数据统计

用Statistica10.0统计软件包完成所有数据的统计分析。使用方差分析和多重比较相应的数据。描述性统计值用平均值±标准误表示，显著性水平设置为α=0.05，不具相同字母上标的不同β-胡萝卜素浓度处理组和对照组间差异显著，且a>b>c>d。

试验所用的计算公式如下：

变态率=Nf/Ni×100%；

增重率=(Wt-W0)/W0×100%；

特定生长率=(lnWt-lnW0)/d×100%。

式中Nf为终末变态尾数；Ni为初始尾数；Wt为终末体重；W0为初始体重；d为投喂天数。

2 结果

2.1 饲料β-胡萝卜素水平对镇海林蛙蝌蚪发育中期的历期和形态的影响

方差分析表明，蝌蚪的中期(第19天)发育历期组间差异显著，对照组的发育历期显著大于50和500 mg/kg处理组。β-胡萝卜素处理组中500 mg/kg处理组与其它3组差异不显著，合并β-胡萝卜素处理组发育数据，显著低于对照组。中期体重、体长和尾长组间差异不显著(表1)。

2.2 饲料β-胡萝卜素水平对镇海林蛙蝌蚪生长指标的影响

如表2所示，实验组间的蝌蚪的增重率、特定生长率、变态率组间差异均不显著。变态时间组间差异显著，随着β-胡萝卜素处理浓度的增加而变态时间缩短，对照组时间最短。

表1 饲料β-胡萝卜素水平对第19天镇海林蛙蝌蚪生长的影响Tab.1 The effects of β-carotene level on the growth development of R.zhenhaiensis tadpoles on day 19

表2 饲料β-胡萝卜素水平对镇海林蛙蝌蚪生长指标的影响Tab.2 The effects of β-carotene level on the growth indexes of R.zhenhaiensis tadpoles

2.3 饲料β-胡萝卜素水平对镇海林蛙幼蛙形态和运动的影响

β-胡萝卜素对幼蛙体长、头长、前臂及手长和后肢长影响显著(表3)，对照组个体的形态指标最小，β-胡萝卜素处理组随着浓度增加而呈现增加的趋势。幼蛙体重组间差异不显著。平均跳跃距离差异显著，β-胡萝卜素500 mg/kg处理组幼蛙平均跳跃距离显著大于1 200 mg/kg处理组和对照组个体，50 mg/kg处理组与其它组间差异不显著。

表3 饲料β-胡萝卜素水平对镇海林蛙幼蛙形态和运动的影响Tab.3 The effects of β-carotene level on the form and motor performance of froglets of R.zhenhaiensis

2.4 饲料β-胡萝卜素水平对镇海林蛙幼蛙肝脏酶活的影响

如图1所示幼蛙的CAT活力差异显著，50 mg/kg β-胡萝卜素处理组个体酶活显著大于其它处理组，但是肝脏T-SOD活力差异不显著。

3 讨论

3.1 饲料β-胡萝卜素水平对镇海林蛙蝌蚪中期发育的历期和形态的影响

Szuroczki等[15]研究表明添加500 mg/kg类胡萝卜素处理组北方豹蛙(Lithobatespipiens)蝌蚪体重显著大于其它处理组，但是发育历期无显著差异。

图1 饲料β-胡萝卜素水平对镇海林蛙幼蛙肝脏抗氧化酶活力的影响Fig.1 The effects of feed β-carotene level on activity of two antioxidant enzymes on R.zhenhaiensis froglets liver

Ogilvy等[16]在热带爪蟾(Siluranatropicalis)使用10 mg/g类胡萝卜素饲料处理组蝌蚪发育历期、体重和体长均显著大于对照组。本研究结果显示，添加50和1 200 mg/kg β-胡萝卜素处理组蝌蚪发育历期小于对照组和500 mg/kg β-胡萝卜素处理组，但是体重、体长和尾长则无差异，这与已有的研究结果不同。分析可能是栖息地(例如食物条件)的差异导致母体中类胡萝卜素含量差异，从而影响卵中类胡萝卜素含量，若母体自身胡萝卜素含量较高，则会减少蝌蚪生长初期对外源类胡萝卜素依赖[17]。

3.2 饲料β-胡萝卜素水平对镇海林蛙蝌蚪生长指标的影响

本研究结果显示蝌蚪的变态率和完成变态时的增重率、特定生长率组间差异均不显著，β-胡萝卜素处理组的变态时间大于对照组且随着浓度增加变态时间缩短，而对照组最短。Keogh等[18]的结果显示，添加1 mg/g胡萝卜素处理组的布罗雨滨蛙(Litoriabooroolongensis)生长速度快于其它处理组，但是对于变态率和变态时间则无影响。Cothran等[19]发现添加10 mg/g类胡萝卜素饲料对树蛙(Lithobatessylvaticus)变态率无影响，但使灰树蛙(Hylaversicolor)变态率下降20%，蝌蚪的生长速度减缓，变态时间均延长。水栖的两栖动物幼体受到甲状腺激素精密调控进行变态，甲状腺激素水平达到峰值的时间越短，蝌蚪越快完成变态[20]。胡萝卜素可以显著延长变态时间，其机制可能是胡萝卜素减缓了甲状腺的发育，延缓甲状腺激素达到峰值的时间，延长蝌蚪完成变态时间[21],更易积累较多的能量进行生长发育，形成更大的个体。

变态时的幼蛙体形大小会影响之后的生长和繁殖，如运动能力、性成熟时间以及繁殖成功率等[22]。本实验结果表明完成变态的幼蛙个体大小与对照组相比更大(体长、头长、前肢、后肢)，这与之前的研究相同。Ogilvy等[16]研究表明使用0.1 mg/g类胡萝卜素浓度饲料红眼树蛙(Agalychniscallidryas)蝌蚪完成变态时体长和体重显著大于对照组。适宜条件下，蝌蚪发育时间较长，积累能量较多，个体的适合度增加[23]。

3.3 饲料β-胡萝卜素水平对镇海林蛙幼蛙运动性能的影响

类胡萝卜素是维生素A的前体，一分子的β-胡萝卜素能够分解为两分子的维生素A，在维持正常视觉、维持细胞生长、分化、骨骼发育等方面发挥重要作用[16]。β-胡萝卜素长期添加可能促进蝌蚪骨骼的生长，体长、头长、前臂及手和后肢长度的提高将利于镇海林蛙幼蛙登陆后对身体的支撑以及跳跃能力[23]。Mcinerney等[24]研究结果表明，使用添加胡萝卜素饲料的个体，在长距离的游泳表现和陆地逃离捕食者实验中，其运动表现均得到了加强。本研究显示长期摄食富含β-胡萝卜素饲料可以增强镇海林蛙幼蛙的跳跃能力，与上述研究结果相似。

3.4 饲料β-胡萝卜素水平对镇海林蛙幼蛙肝脏酶活的影响