东北地区10个桑品种叶片1-脱氧野尻霉素含量的测定

任立松 葛建兵 蔡兴忱 刘孝良 吴 艳

(1.辽宁省蚕业科学研究所，辽宁凤城 118100； 2.中国农业大学，北京 100083)

DNJ首先是由M.Yagi等从桑树(MorusalbaL.) 根皮中分离得到的一种天然生物碱，并定名为“moranoline”[1]，中文名称1-脱氧野尻霉素。这种生物碱是哺乳动物α-糖苷酶的强效的糖代谢酶抑制剂。DNJ可显著延缓多糖的降解过程，通过降低碳水化合物消化和葡萄糖的吸收可降低餐后血糖的峰值。此外，DNJ还有胰岛素增敏的作用，可改善胰岛素抵抗的症状，还具有抗病毒、抗肿瘤转移等药理作用。桑树中的DNJ主要分布在桑树的叶、枝和根，桑叶占整个桑树干物质的比例最大，约占其65%，因而桑叶已经成为目前获取天然DNJ的主要来源，但其含量大小易受到桑树产地、品种、叶位、采摘时期、生长环境等因素的影响。本文对东北三省主要栽培的10 个桑树品种的叶片进行DNJ测定，以探明东北地区各桑种品种间DNJ含量的差异，为北方地区桑树药食用途品种选育和桑树资源多元化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为辽宁省蚕业科学研究所桑树种质资源圃中栽植的东北三省主要桑种品种，包括辽宁省的辽鲁11号，辽育8号，辽育16号，辽育166号，辽剑44号，白果桑，鲁桑11号和顺山秋雨8个品种，吉林省的吉湖四号，黑龙江省的龙桑1号，共10个品种。于 2017 年 8月上旬采摘植株上部枝条第4—6位叶，50 ℃烘干至恒重。以上样品粉碎后过 60目筛备用。

1.2 方法

1.2.1 试剂

浓盐酸、乙酸铵、氯化钾、硼酸、氢氧化钠(分析纯，北京化工厂)；

乙腈(色谱纯，北京百灵威科技有限公司)；

冰乙酸(色谱纯，天津津科精细化工研究所)；

9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl，纯度>98%，北京百灵威科技有限公司)；

1-脱氧野尻霉素标准品(纯度≥99%，北京世纪奥科生物技术有限公司)；

去离子水采用Milli-Q(Millipore，bedfford，MA)系统制备的超纯水(电阻率≥18.2 Ω，美国Millipore公司)。

1.2.2 仪器与设备

高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD，型号：Agilent 1260，美国安捷伦公司)；

色谱柱Agilent Zorbax Eclipse plus C18 (4.6 mm×150 mm，5.0 μm，美国安捷伦公司)；

电子天平(BSA224S-CW)(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；

DHG-9123A型电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；

涡旋振荡器，高功率数控超声波清洗器(KQ-600DA型，昆山市超声仪器有限公司)；

离心机(TGL-20bR，上海安亭科学仪器厂)；

高速万能粉碎机(FW100， 天津市泰斯特仪器有限公司)；

2 mL一次性注射器(上海治宇医疗器械有限公司)；

10 mL离心管，100 mL 容量瓶，0.22 μm有机相滤膜(北京蓝弋公司)；

pH计(PHS-2F，上海仪电科学仪器股份有限公司)。

1.2.3 待测样品的制备

精确称取桑叶粉0.5 g于50 mL离心管中，加入25 mL 0.05 mol/L盐酸溶液，超声水浴20 min，离心[7012(×g), 5 min],取上层清液于50 mL容量瓶中，残渣重复提取1次，合并两次上层清液，最后用提取溶剂定容至50 mL，待测。

吸取100 μL 待测液，准确加入100 μL 硼酸盐缓冲液，再准确加入700 μL FMOC-Cl，涡旋振荡30 s，然后30 ℃水浴反应10 min。完成后过0.22 μm 水相滤膜进行HPLC测定。

1.2.4 上机条件

参考魏兆军等人[2]的方法，并有所改动。采用高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)对桑叶中的生物碱类成分进行分析，并主要对DNJ进行定性分析。

色谱柱Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5.0 μm)；流动相A为10 mmol/L乙酸铵、pH4.0的缓冲溶液，流动相B为乙腈与甲醇之比为1∶1的洗脱液。梯度洗脱，洗脱程序见表1。柱温25 ℃；流速0.800 mL/min；进样量10 μL；检测波长254 nm，采集时间40 min。

表1 HPLC-DAD的洗脱程序

1.2.5 数据分析

所有数据使用Microsoft Excel 2010(美国微软公司)进行统计处理。所有的数据都是每个样品3个平行，以平均值表示。

2 结果

2.1 不同桑树品种间桑叶中DNJ含量及相关性状的遗传差异

桑叶样品中的 DNJ 含量见表2。

表2 东北地区主要桑树品种桑叶中DNJ含量

由表2可以看出，10个桑树中DNJ 含量最高的是辽剑44号(3.306 mg/g)，依次是辽育8号、辽育166、辽鲁11号、辽育16、白果桑、鲁桑11号、顺山秋雨、龙桑1号和吉湖4号。

10个桑树品种中鲜叶重最重的品种是辽育166(6.446 g)，其次是辽育8号(5.641 g)和辽剑44(5.607 g)，鲜叶重最轻的是顺山秋雨(3.391 g)；干叶重最重的是辽育166(1.740 g)，其次是辽育16(1.579 g)和辽育8号(1.575 g)，干叶重最轻的是顺山秋雨(0.933 g)。脱水率最高的是辽剑44(74.62%)，其次是辽鲁11(73.32%)和辽育166(73.01%)，脱水率最低的是鲁桑11号(63.11%)。

2.2 桑叶中DNJ含量与相关性状间的相关关系

对桑叶中DNJ含量及鲜叶重、干叶重和脱水率之间进行相关分析，以探索各性状间的相互关系，分析结果见表3、图1-3。

表3 DNJ含量与鲜叶重、干叶重、脱水率的相关关系

项目参数DNJ含量/(mg/g)鲜叶重/g干叶重/g脱水率/%DNJ质量比/(mg/g)r10.7350.4800.594p0.0150.1600.070鲜叶重/gr0.8670.460p0.0010.181干叶重/gr-0.040p0.912

图1 DNJ含量与鲜叶重的相关关系

图2 DNJ含量与干叶重的相关关系

图3 DNJ含量与脱水率的相关关系

1)从表3可以看出，鲜叶重与DNJ含量呈显著的正相关关系，相关系数为0.735。从图1可知，鲜叶重较轻时，其DNJ含量较低，但也不是DNJ含量越高，鲜叶重就越大，从图中可以看出当鲜叶重达到5.5 g以上时，DNJ的含量相对较高。鲜叶重最大时，DNJ的含量并不是最高的。因此，要想获取DNJ含量较高的桑叶，应选择单叶重在5.5 g以上的桑树品种。

2)从表3可以看出，DNJ含量与干叶重呈正相关关系，但不显著，相关系数为0.48。从图2可知，DNJ含量最高的桑树品种其干叶重并非最大，干叶重最大的其DNJ含量介于群体均值左右。因此也无法根据桑树品种的干叶重来判断其DNJ含量的高低。

3)从表3可以看出，桑叶中DNJ含量与桑叶脱水率呈正相关关系，达到了准显著水平，其相关系数为0.594。从图3可知，虽然DNJ含量没有完全随着脱水率的增加而增加，但还是有一定的相关趋势。

3 结 论

10个桑树品种中桑叶DNJ含量最高的是辽剑44号，其它品种按DNJ含量高低依次是辽育8号、辽育166、辽鲁11号、辽育16、白果桑、鲁桑11号、顺山秋雨、龙桑1号和吉湖4号。排名第2、第3、第4的是辽育8号、辽育166和辽鲁11号，这3个品种是辽宁省蚕业科学研究所自上世纪80年代以来选育的主要桑树品种，具有优质、丰产和抗寒的特性，并在辽、吉、黑等地大面积推广应用。随着现代科技的发展和市场的变化，蚕桑产业已向蚕桑资源的多元化综合利用方向发展，DNJ含量的测定可为北方地区桑树药食用途品种选育提供科学依据。

DNJ含量与鲜叶重呈显著的正相关关系，虽然与干叶重和脱水率也有一定的正相关关系，但相关程度均不显著，因此可通过判断不同桑树品种的鲜叶重来推断DNJ含量的高低。