结核分枝杆菌异烟肼和丙硫异烟胺耐药及其交叉耐药相关机制研究进展

王晓英，张汇征，罗 明,曾婉婷

结核病是一种由结核分枝杆菌(MycobacteriumTuberculosis，MTB)感染引起的慢性传染病，是由单一致病菌引起的死亡人数最多的疾病[1]。我国结核病疫情严重，仅次于印度，居世界第2位。据世界卫生组织(World Healthy Orgnization，WHO)估算，2018年全球新发结核病患者数为1 000万，耐多药(Multi-Drug Resistant，MDR)结核病患者数为48.4万[2]。MDR患者化疗疗程约为20个月或更长，但治疗效果却不理想，治疗成功率仅为54%，病死率达16%。2010年全国第5次结核病流行病学抽样调查报告显示，我国结核病患者对异烟肼(isoniazid, INH)的总耐药率最高，达28.6%，对二线抗结核药物丙硫异烟胺(prothionamide, Pto)的总耐药率达12.9%，总耐药顺位分别排第1位和第4位；其中，初治肺结核患者INH与Pto的耐药率分别为第1位和第4位，复治肺结核患者INH与Pto的耐药率分别为第1位和第5位[3]。由此可见，我国INH与Pto的耐药情况已经非常严峻。快速准确的预测结核病患者对抗结核药物的耐药性，有助于患者及时有效的治疗。结核病耐药的快速检测依赖于对耐药机制的研究，因此，充分了解INH和Pto交叉耐药的相关机制，有助于对这两种药物耐药性的精确检测和其临床上的合理使用。

1 异烟肼及丙硫异烟胺作用机理

1.1异烟肼作用机理 INH是目前使用的重要一线抗结核药物，是一种需要经过氧化反应才能变得有活性的前体药物。INH作用于MTB细胞壁分枝菌酸的合成，它通过抑制参与MTB细胞壁生物合成的烯酰基载体蛋白还原酶inhA而达到杀菌的功效[4]。INH易渗入吞噬细胞，对细胞内外的MTB均有杀菌作用，故称“全效杀菌药”[5]。

1.2丙硫异烟胺作用机理 MTB对INH耐药后，临床上通常用Pto来代替INH组成治疗方案[5]。Pto属于口服抑菌二线抗结核药物，也是一种前体药物，被广泛用于耐多药结核病、敏感菌导致的结核性脑膜炎及粟粒性结核等多种结核病的治疗中[6-7], 也适用于非结核分枝杆菌病的治疗[5]。Pto与乙硫异烟胺(Ethionamide, Eto)均属硫胺类药物，为异烟酸的衍生物，可通过抑制MTB分枝菌酸的合成并扰乱MTB细胞膜的合成而发挥抗结核功效[5,7-8]。

2 异烟肼和丙硫异烟胺交叉耐药机制

Pto与Eto显示出高度的交叉耐药性，因此，Eto耐药相关基因突变成为研究Pto耐药机制的主要依据。Pto、Eto与INH的作用相似，存在部分的交叉耐药性[9]。

2.1inhA基因 INH和Pto均属于前体药物，需要不同的酶进行活化后才能发挥作用，但两种药物有共同的作用靶点：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD),NADH依赖的烯酰基乙酰载体蛋白还原酶，涉及到分枝菌酸合成的inhA[10-11]。inhA基因编码分枝杆菌脂肪酸合成酶II系统中的一种烯酰基乙酰载体蛋白还原酶，激活的INH共价结合到NAD上形成加合物而附着到inhA上[12]。因此，inhA基因或/和inhA启动子区域基因突变可导致inhA基因编码产物的过表达或者修饰，降低了inhA酶与NADH的亲和力，从而造成INH与Pto的交叉耐药[13-15]。研究表明，在INH与Pto同时耐药的菌株中，33.5%的菌株存在INH与Pto交叉耐药的情况，由inhA和/或其启动子区域的单一突变或者两者同时突变导致；交叉耐药菌株中，最常见的突变为inhA启动子区域-C15T突变，占26%。但在INH耐药Pto敏感或INH敏感Pto耐药菌株中，存在3例inhA启动子-C15T突变的情况，可能与其他调整因子的代偿突变有关[16]。

目前关于INH与Pto交叉耐药的研究较少，多是关于INH与Eto交叉耐药情况的研究。一项关于INH与Eto交叉耐药的研究表明，94%的MDR菌株在inhA启动子区域存在突变，突变类型为-C15T[17]。而另一项关于INH与Eto交叉耐药的研究表明，33.3%Eto耐药的MDR菌株中存在inhA启动子区域或inhA基因突变，在66.6%的交叉耐药菌株中可见inhA启动子区域-C15T突变[18]。而南非东开普省的研究表明，inhA启动子区域-C17T突变在XDR-TB菌株中是主要的突变类型，达到83%[19]。inhA基因编码区域突变比较少见，目前研究表明，在INH和Eto交叉耐药菌株中，inhA基因编码区域氨基酸突变位点仅有I21T, S94A和I95P[20-21]。但inhA基因突变及其启动子区域突变导致的交叉耐药在不同地区的差异很大，从12%到100%不等[20, 22-26]。

2.2ndh基因ndh基因编码NADH脱氢酶，其在耻垢分枝杆菌的研究中首次被认为与INH的耐药机制有关。研究表明，ndh基因编码的NADH脱氢酶对于耻垢分枝杆菌的存活至关重要，而NADH脱氢酶通过将NADH氧化成NAD+而提高INH的活性[27]。随后的研究表明，ndh基因突变只出现在INH耐药的MTB菌株中，说明ndh基因突变与MTB对INH耐药有关。ndh基因突变降低了NADH氧化成NAD+的速率，从而导致了NADH的累积以及NAD的缺乏[28]，增加的NADH水平可能竞争性的抑制了INH-NAD加合物附着到inhA酶的活性位点[29-30]，从而破坏了酶活性的调整并可能引起INH和Pto的交叉耐药[31]。也可能因为NADH是过氧化物酶AhpCF和KatG的底物，NADH浓度的增加可能竞争性抑制KatG对INH的过氧化作用[27]。Miesel等人的研究也表明增加的NADH浓度阻止了INH和Eto的作用从而导致高水平耐药[27]。

在耻垢分枝杆菌和牛分枝杆菌中已经发现ndh基因突变可导致INH与Eto交叉耐药[32]。来自新加坡和巴西的研究也表明ndh突变(R13C、T110A和R268H)发生在8%～10%的异烟肼耐药菌株中，但并不存在于INH敏感的菌株中[28,33]。但其他相关研究表明，ndh突变在INH耐药和敏感菌株中均存在[20]。最新的关于结核分枝杆菌INH和Pto交叉耐药的研究中，仅在ndh基因中新发现了一个非同义突变(G339A)，且其仅与INH耐药相关[16]。因此，目前ndh突变与INH和Pto交叉耐药的相关性并不是很明确，还需要进一步的研究来证实。

2.3fabG1-inhA基因fabG1基因(又称为mabA)g609a突变首先被发现与INH耐药相关[34]。fabG1基因沉默突变导致INH和ETH耐药。fabG1基因g609a突变及与它临近的区域扮演了inhA基因启动子的作用，增强inhA的转录，导致inhA的过表达，降低了inhA酶与NADH的亲和力，从而导致INH和ETH的交叉耐药。fabG1基因g609a突变也可能通过增加转录的稳定性和改变RNase在mabA-inhA mRNA中的裂解位点来影响inhA转录的水平，最终导致INH和ETH的交叉耐药[35]。fabG1基因突变已被用于预测MTB对INH耐药的检测中[36]，但目前MTB对Pto耐药及INH与Pto交叉耐药相关研究中并未对fabG1基因突变情况进行检测[16,37]。因此，fabG1基因突变是否与INH和Pto的交叉耐药相关以及其相关的耐药机制，还需要进一步的实验验证。

3 异烟肼耐药的其它机制

除与Pto交叉耐药的相关机制外，导致MTB对INH耐药的主要分子机制主要与katG、ahpC、kasA和oxyR等基因突变有关。katG基因突变导致过氧化氢酶-过氧化物酶的形成受阻，不能活化INH为具有杀菌作用的异烟酸，从而导致MTB对INH耐药[38-39]。最常见的KatG突变为S315T突变，94%的INH耐药菌株与S315T突变相关[40]。各个地区INH耐药菌株中因katG基因突变而导致的耐药比率差异很大，从31.8%～96.9%不等[41]。ahpC基因在INH耐药中起着重要的作用。由ahpC基因编码的AhpC酶(alkyl hydro peroxidase)引起过氧化氢底物的减少，ahpC基因启动子区域的突变能够增强ahpC蛋白的表达，从而代偿性抵抗KatG/CP活性的丢失[42]。oxyR是一种氧化应激调节蛋白，控制着编码解毒酶基因触酶-过氧化物酶(katG编码)和烷基氢过氧化物酶(ahpC编码)的表达[43]。29%的INH耐药临床株在oxyR-ahpC基因间隔区存在突变[43]，oxyR-ahpC基因间隔区突变，例如-G9A和-C15T可分别增加ahpC的表达达9倍和18倍[42]。但oxyR-ahpC基因间隔区突变是否与INH耐药相关目前还存在争议[44]。kasA基因编码的KasA(β-酮脂酰基酰载体蛋白合成酶) 能促进分枝菌酸的生物合成[25]，但kasA基因突变在INH耐药中的作用并不是很清楚[34,45-46]。因此，INH耐药菌株相关基因(如ahpC、kasA和oxyR)突变的具体位点及其与INH临床耐药的确切关系还不是很明确，需要进行更深入的研究。

4 丙硫异烟胺耐药的其它机制

除与INH交叉耐药的机制外，Pto耐药主要与ethA、ethR和mshA等基因突变有关。ethA基因可编码加单氧酶ethA，Pto经加单氧酶ethA激活后与NAD+反应，产生 Pto-NAD加合物，从而抑制inhA基因及分枝菌酸的合成[47-50]。Brossier等的研究结果表明，47%的Eto耐药菌株存在ethA基因突变(F110L和 A95T突变)[31]。多项研究表明，ethA基因的非同义突变和框架突变可导致Pto/Eto耐药，所占比例从37%到100%不等[15,25,37,51]。另外，Islam等的研究发现了ethA基因上29个新的非同义突变和3个截断突变与Pto的耐药相关[16]。ethR是TetR/CamR家族的一员,可抑制ethA基因的表达[52]。抑制ethR基因的功能将导致MTB对Pto的敏感性提高，而ethR基因突变则会导致Pto耐药[49]。ethR基因突变(F110L和 A95T)与Eto耐药相关，约占Eto耐药菌株的4%[31]。ethR基因上两个新的非同义突变 (R216C和V152M)和一个同义突变也被证实与Pto耐药相关[16]。mshA属于糖基转移酶家族，涉及到MTB分枝硫醇的生物合成[11]，mshA基因突变可能与Pto/Eto的激活被破坏有关[11,15,31]，但mshA基因突变与Pto/Eto耐药的相关性并不是很明确，有待进一步的研究。目前，MTB对Pto耐药的相关机制研究较少，多基于对Eto耐药机制的研究，相关基因突变的具体位点及其与临床耐药的相关性仍需要进行更深入的研究。

5 展 望

随着分子生物学技术的发展，INH的耐药机制也越来越明确，但目前MTB对Pto耐药相关突变基因以及突变位点的分析仍然非常有限，还存在未知的基因突变。已有研究表明，20.2%的Pto耐药菌株中未发现已知的基因突变[16]，在未知的耐药基因突变中也有可能存在与INH交叉耐药相关的机制。另外，MTB因受各种因素的影响，其遗传特点多存在显著的地域差异。目前，我国INH和Pto耐药情况已经比较严峻，尤其是两者之间存在着交叉耐药的情况。对于INH和Pto交叉耐药机制的研究也十分有限，需要进行更加深入的研究以探索其作用的新机制。对INH与Pto交叉耐药机制的研究可为结核病相关耐药基因检测技术的发展提供参考，为耐药结核病的诊断及临床医生的合理用药提供科学依据。

利益冲突：无。