肠道菌群对骨质疏松的影响机制及治疗的研究进展

谢 辉，林上阳，夏晨洁，吴 丽，陈志鹏，李伟东

(1.南京中医药大学药学院, 2.江苏省中药炮制重点实验室, 3.江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏 南京 210023)

肠道具有人体最大的细菌群落，每个人都携带多达数百种的肠道细菌。微生物群给予宿主包括维生素的生产，从饮食中提取营养和能量，代谢功能，先天和适应性免疫的调节，以及对病原微生物的保护。微生物组的改变与人类的一些慢性疾病有关，包括炎症性肠病、肥胖症、代谢性疾病、营养不良、神经系统疾病、癌症和心血管疾病[1]。

中国国家卫生健康委员会2018年调查显示，骨质疏松症已经成为中国中老年人群的重要健康问题，中老年女性骨质疏松问题尤为严重。50岁以上女性骨质疏松症患病率为32.1%,65岁以上女性的骨质疏松症患病率更是达到51.6%。在不经意间影响着人类的健康，多见于疼痛、驼背。更严重的是，在日常运动中，家务过程中，即使没有明显较大的外力作用，不经意间便可发生骨折，多发生于胸、腰椎椎体、桡骨远端及股骨上端，阻碍人们的日常生活，降低人民生活幸福感。除此之外，骨质疏松引发的胸、腰椎压缩性骨折会降低呼吸功能，出现呼吸困难等情况。目前针对绝经后骨质疏松的治疗药物主要包括双膦酸盐、选择性雌激素受体调节剂、激素替代剂和降钙素等，临床实验证实这些药物均有较好的临床疗效。但部分药物的潜在并发症及副作用也随之突显[2]。而对于继发性骨质疏松研究较少，所以亟需寻找到新的靶点，开辟一条安全有效的途径，治疗多种因素引起的骨质疏松症。

肠道微生态与骨代谢的相关性是近年来研究的热点，研究发现，肠道菌群与骨质疏松症的发病相关[3]，肠道中的微生物可能通过自身代谢产物、影响宿主代谢、调节肠道屏障功能以及免疫系统、转化药物代谢等途径影响骨质疏松。本文将通过由肠道菌群介导的诸多途径阐述肠道菌群影响骨质疏松的机制，并对靶向肠道治疗骨质疏松的药物进行综述。

1 肠道微生物影响骨质疏松症机制

1.1 肠道菌群自身代谢产物短链脂肪酸(SCFAs)是肠道菌群的代谢产物，由羧酸和小烃链组成。其中，乙酸、丙酸和丁酸的研究最多，其化学结构分别为 2 、3 、 4 个碳。Lucas等[4]通过对小鼠喂SCFA丙酸酯 (C3) 和丁酸酯 (C4),使体内的SCFAs含量增加，测得小鼠的骨含量显著增加，由此可以表明 SCFAs 含量对于骨量的保护有一定的作用。而从机制上说，一方面，体内实验发现，骨吸收标志物血清水平显著降低，另一方面，体外实验表明, C3 和 C4 显著抑制了两个必需的破骨细胞信号转导成分 TRAF6 和 NFATc1，这些实验从不同角度有力的表明与骨吸收的抑制有关，SCFAs 对骨形成也有一定的影响。Tyagi 等[5]研究发现，丁酸盐能够增加调节性 T 细胞(Treg) 在肠道和骨髓中的数目，而 Treg 细胞能够刺激CD8+T细胞分泌 Wnt 配体Wnt10b,从而通过激活成骨细胞中的 Wnt 信号刺激骨形成。间充质干细胞(NSCs)具有成骨和成脂的能力， Chen 等[6]研究表明，MSCs当被诱导进行成骨分化时，丁酸钠能够刺激成骨分化并上调 Runx2 和 Runx2 调节基因的表达，也能够通过激活细胞外调节蛋白激酶调节间充质干细胞分化。

除了通过直接干预破骨细胞分化及骨形成等，SCFAs还可以影响矿物质的吸收。试验结果表明，SCFAs可通过调节矿物质离子与氢离子之间的电解质交换，直接影响肠道对矿物质的吸收，促进上皮细胞对矿物质离子的吸收[7]。SCFAs 可以降低肠腔内的pH值，增加钙在大鼠结肠段的转运，促进钙的吸收。在牛中，丁酸可以激活中性粒细胞，诱导钙离子(Ca2+)内流和丝裂原活化蛋白激酶磷酸化，丙酸盐会增加中性粒细胞 Ca2+内流[8]。综上所述，肠道菌代谢产物短链脂肪酸能够有效的干预骨质疏松症，为骨质疏松症的预防与治疗提供新手段。

1.2 宿主-微生物群共代谢肠道微生物群的组成和活动自出生起就与宿主共同发育，并受到宿主基因组、营养和生活方式之间复杂的相互作用影响。越来越多研究表明，肠道微生物群通过一系列相互作用的宿主-微生物群代谢、信号传导和免疫炎性轴，参与调节多种哺乳动物体内的代谢途径，这些轴在生理学上连接肠道、肝脏、大脑和其他器官[9]。

Xing等[10]分析慢性深度缺氧条件下骨髓间充质干细胞与肠道菌群的关系。成骨细胞由骨髓间充质干细胞分化而来，成骨细胞的成骨作用不能够平衡破骨细胞介导的骨吸收，导致骨量降低是骨质疏松的发病机制之一。结果发现，慢性深度缺氧导致肠道微生物群落多样性发生改变，乳酸菌显著减少，降解 D-半乳糖的酶减少，使D-半乳糖累积，而累积的D-半乳糖使血液和骨髓中能够诱导骨髓间充质干细胞过早衰老的活性氧积累。

要研究肠道菌群和宿主之间的这一复杂的代谢体系，代谢组学是目前较为有效的研究手段。Xu 等[11]采用非靶向代谢组学策略，发现苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等代谢途径是糖皮质激素诱导的骨质疏松大鼠代谢功能改变最多的途径。大多数代谢途径与糖代谢、分子转运和脂质有关。龙维富等[12]研究绝经后骨质疏松的血浆代谢组学发现，与假手术组比较,去卵巢组大鼠代谢产物乳酸、丙酮和乙醇水平升高,而胆碱/磷脂酰胆碱、丙氨酸、 VLDL/LDL 、 HDL/LDL 、血糖及脂肪酸水平降低。如核糖体，糖酵解，氨基酸生物合成，碳代谢，和氧化磷酸化，已被证明调节骨髓间充质干细胞增殖和分化，影响骨形成。郑晓皎[13]通过对抗生素干扰实验，利用 UPLC/QTOFMS 和 GC/TOFMS 色谱质谱联用技术，建立了肠道菌群-宿主代谢物组的全谱和靶标分析平台。其中，色氨酸代谢途径、酪氨酸、苯丙氨酸代谢途径、脑-肠轴、短链脂肪酸和糖类物质、中长链脂肪酸和胆酸类物质等以及代谢的改善与肠道微生物群的改变密切相关[14]。综上所述，骨质疏松症的治疗与宿主代谢有着密不可分的关系，而肠道菌群又影响着一些宿主代谢，形成肠道菌-宿主共代谢。但是关于这方面的靶向性来影响骨质疏松的机制研究的还不够深入，还需要进一步深入研究，也为骨质疏松的预防与治疗提供了新思路，具有社会价值。

1.3 肠道屏障与免疫肠道屏障在维持宿主体内平衡中起重要作用。肠上皮由连续的单层肠上皮细胞组成，其通过紧密连接(TJ)蛋白密封在一起。TJs是由Claudins蛋白、Occludin蛋白和Zo蛋白组成的一种蛋白质复合物,决定了细胞外溶质的渗透性。肠上皮被一层粘液覆盖，由粘蛋白组成，形成物理屏障。该屏障阻止了微生物与上皮表面的相互作用，抑制细菌粘附到肠上皮细胞，限制免疫反应和维持屏障功能。肠道微生物群的生态失调，使具有降解粘蛋白能力的细菌丰度增加，影响粘蛋白产生[15]。粘蛋白的减少，使细菌更多黏附到肠上皮细胞，使肠上皮细胞上的模式识别受体发出信号，激活 NF-κB 通路。上皮细胞 NF-κB 活化增加促炎细胞因子，如 TNF-α、IL-1和INF-γ等。几种细胞因子可以调节TJ复合物，TJ连接其顶端侧的相邻上皮细胞，TJ蛋白复合物由连接粘附分子、occludins、桥粒、密蛋白和细胞骨架连接蛋白组成，提供粘合力以确保上皮层的完整性。TNF-α增加肌球蛋白轻链激酶的表达，IFN-γ降低ZO-1蛋白合成，增加TJ蛋白的内化并重新排列肌动蛋白细胞骨架。使得上皮层完整性被破坏，肠道通透性增加[16]。肠道通透性增加，导致肠道菌群中的有害菌以及产生的影响骨质疏松的有害代谢物可以进入机体，进一步引发免疫应答，并且生成大量以TNF-α为主的促破骨细胞生成因子,TNF-α诱导核因子κB受体活化因子配体和巨噬细胞集落刺激因子的生成，并下调骨保护素，最终促进破骨细胞的激活和骨吸收[17]。 Xiao等[18]通过体外实验发现，无菌组与无特定病原体 (SPF) 组骨髓间充质干细胞与 T 细胞共培养，并检测它们诱导 T 细胞凋亡的能力，发现 SPF 组显著诱导更多的 T 细胞凋亡。综上所述，肠道菌群失调、肠道上皮屏障功能减弱和免疫系统反应性增强，导致肠道致病菌有害代谢物可以通过肠道上皮屏障进入机体，进一步引发CD4+T细胞介导的免疫应答，生成大量以TNF-α为主的促破骨细胞生成因子，最终促进破骨细胞的激活和骨吸收。

1.4 中药和肠道菌群相互作用中药具有调节肠道菌群结构，保护肠黏膜屏障的作用，而肠道菌群代谢转化中药有效成分，使其更易被机体吸收，还有增强药效、降低毒性的作用。传统中药吸收利用度不高，但疗效好，因肠道菌群在其中的转化作用。肠道菌群对中药成分的生物转化以水解作用为主，氧化还原作用为辅，在这些水解酶、氧化还原酶、裂解酶和转移酶等代谢酶的作用下，中药成分转化成相应的药理或毒理成分而发挥作用[19]。迄今已发现的植物雌激素有400多种, 其中肠道菌群对黄酮类、异黄酮类、木脂素类研究较多。

异黄酮类在肠道菌群的转化下会代谢成雌马酚，而雌马酚具有更强雌激素样作用，对于绝经后骨质疏松的预防有较好的疗效。木脂素类化合物如松脂醇二葡萄糖苷以及牛蒡苷等需经肠道菌群转化为哺乳动物中的木脂素如肠二醇和肠内脂后，才能呈现出一定的雌激素样活性，动物木脂素在结构上与雌二醇等内源性雌激素结构相似。因此，可与内源性雌激素竞争性与雌激素受体(ER)结合，抑制或结合ER，进而产生双相的雌激素或抗雌激素样作用，用于治疗骨质疏松[20-21]。

2 靶向肠道制剂

2.1 益生元治疗骨质疏松根据定义，益生元纤维具有抗吸收性，并且通过下肠中的结肠微生物群水解和发酵。当以足够的量掺入饮食中时，期望的结果是它们将选择性地刺激对宿主具有有益作用的一些细菌的生长[22]。近年来，以肠道菌群为靶点治疗骨质疏松成为热点，多种实验表明补充益生元对骨质疏松症有治疗作用。益生元在各种食物中发现的化合物中含有，例如菊苣，大蒜，韭菜，香蕉，洋葱和麸皮中。二糖具有两个糖单元，例如乳果糖或乳糖醇，它是最早与肠道微生物群体相关的益生元之一。低聚糖含有3～10个糖单位。包括短链低聚果糖、低聚半乳糖。较长链接的益生元>10单位包括菊粉和抗性淀粉。低聚果糖均增加雌激素缺乏的卵巢切除大鼠的钙吸收，还可通过减少雄性衰老小鼠的全身炎症，改善肠道微生物群，减少骨吸收[23]。口服甘露聚糖对大鼠牙周炎引起的牙槽骨丢失具有保护作用，在保护肠道的同时，可改变组织学和免疫炎性参数[24]。Tousen等[25]发现，抗性淀粉通过改变肠道菌群的组成，从而下调去卵巢小鼠骨髓中核因子 kappa-B 配体受体激活因子和IL-7受体基因的表达，从而减轻卵巢切除引起的骨质流失。

2.2 中药治疗骨质疏松依据补充益生元能够有效治疗骨质疏松症，将肠道菌群作为药物治疗骨质疏松的新靶点，对药物产生药效做出新阐释。以纳豆芽孢杆菌发酵大豆而得的纳豆具有溶血栓、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、预防骨质疏松症以及调节肠功能等许多作用，通过实验表明纳豆能够显著促进健康小鼠及抗生素诱导的腹泻模型小鼠肠道中厌氧菌群的生长，抑制好氧菌群的增殖，有望成为一种益生元类物质应用于食品、药品等行业中[26]。在慢性炎症性肠病动物模型中适度提高大豆饮食，可以降低肠道炎症分数和结肠基因表达的 TNF-α,有效地减轻肠道炎症、淋巴结构改变和有益地改变骨代谢。大豆素是一种在大豆中发现的主要异黄酮，可通过肠道菌群代谢为雌马酚，该产物具有比大豆苷元更强的雌激素活性，对骨骼健康产生有利影响[27]。桑树和蒲公英水提取物可以降低大肠内厚壁菌门与拟杆菌门的比例，肠道菌群的变化改变了能量代谢和葡萄糖代谢，可以治疗酒精性脂肪肝引起的骨质流失[28]。Jia 等[29]研究小檗碱治疗绝经后骨质疏松症引发的牙周炎，发现小檗碱通过富集产丁酸属菌群，提高肠道丁酸盐浓度，治疗后肠道屏障完整性得到改善，肠道通透性降低，牙槽骨 IL-17A+细胞减少，IL-17A相关免疫反应减弱，明显降低了去卵巢-牙周炎大鼠的牙槽骨丢失，改善了骨代谢。Zhao等[30]研究发现，墨旱莲能够改变细菌群落从而显著改善骨微结构，并且发现乳酸杆菌和乳球菌的数量与墨旱莲的剂量呈正相关。

3 展望

目前在临床上用于治疗和阻止骨质疏松症发展的药物分为两大类，第一类为抑制骨吸收药，包括钙剂、维生素 D 及活性维生素 D 、降钙素等；第二类为促进骨性成药，包括氟化物、合成类固醇、甲状旁腺激素等。让人感到兴奋的是，近年来有大量研究表明补充益生菌也可以防止骨质疏松，并且益生菌用药治疗骨质疏松也用于临床治疗，这是区别于传统防治骨质疏松的一大突破，对于靶向肠道制剂提供了一定的理论基础。本文在此的基础上，梳理了肠道菌群影响骨质疏松的可能因素，为下一步的研究奠定基础。

肠道菌群的研究是目前的难点和热点，中药对肠道菌群的调节作用逐步被认可，现在大部分的研究还是停留在单味药，而在中医基础理论下，中药经过炮制配伍能够更好地发挥药效，而对于中药复方的研究较少，是不足所在。中药复方治疗骨质疏松的疗效得到认可，但中药复方化学成分极其复杂，其对骨质疏松的治疗是多途径和多靶点的，目前对中药复方的多靶点还有待在分子水平和基因水平进行深入的研究，而肠道菌群作为新靶点，为中药治疗骨质疏松提供了新的阐释，也能够从肠道新靶点探寻更多药物预防与治疗骨质疏松症。而是否所有靶向肠道制剂的中药都能够调节骨质疏松呢？骨质疏松究竟和哪些特殊的菌群或者菌落有密切关系，目前研究还较少，不能够筛选出靶向肠道制剂治疗骨质疏松的最佳中药复方。之后，我们需要针对如何将中药复方中的某些最有效成分群与治疗骨质疏松最有效肠道菌联系起来，制备出疗效显著的新剂型，明确中药复方如何通过肠道菌群治疗骨质疏松进行深入研究。