白细胞介素17D的研究进展①

刘旭莹 孙思予 刘冬妍 (中国医科大学附属盛京医院消化内科和实验研究中心,辽宁省环境与代谢疾病动物模型研究与应用重点实验室，沈阳 110004)

炎症发生时免疫细胞会动员到感染或伤口部位，是人体对病原体、过敏原和有毒化学刺激伤害感染身体时的直接保护性反应，在这一过程中，白细胞介素17(IL-17)的作用不容忽视。IL-17是个大家族，由6个相关分子组成：IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(也称为IL-25)和IL-17F，其中IL-17D了解很少。

1 IL-17家族成员

目前已确定在IL-17家族成员中，IL-17F与IL-17A的同源性最高(40%～55%)，其次是IL-17B(29%)、IL-17D(25%)、IL-17C (23%)和IL-17E(17%)[1,2]。不同的成员氨基酸序列不全相同，表明它们分别具有不同的作用。由于IL-17A最先在啮齿动物cDNA的转录物中被鉴定出来[3]，对于它的功能研究较为详细。IL-17A主要由活化的CD4+T细胞产生，它参与中性粒细胞和巨噬细胞募集以及许多其他细胞因子的释放，还与许多炎症和自身免疫性疾病有关，包括关节炎、克罗恩病、银屑病、哮喘和囊性纤维化等[4]。IL-17F与IL-17A的同源性最高，因此它们具有很多相同的生理学功能，但由于存在氨基酸序列的不同，它们也执行不同的功能：IL-17A参与自身免疫性疾病、炎症和肿瘤的发展，并在宿主防御细菌和真菌感染方面发挥重要作用，而IL-17F主要参与黏膜宿主防御机制[5]；IL-17B可以诱导单核细胞系中TNF及IL-1β的表达并导致中性粒细胞浸润，表明它具有影响肿瘤进展的潜力；IL-17E，促进Th2细胞因子的产生和嗜酸性粒细胞的募集，以提供针对蠕虫感染的保护并调节过敏反应[6,7]；IL-17C是孤儿受体IL-17RE的配体，研究表明，IL-17C-IL-17RE途径对于预防肠道病原体感染以及包括银屑病、炎症性肠病和多发性硬化症在内的几种自身免疫疾病的发病机制至关重要[8-11]。尽管IL-17D具有与IL-17A和IL-17F相似的诱导炎症介质的能力，但它在免疫系统中的作用仍然很大程度上是未知的[5]。与其他IL-17家族成员不同，IL-17D优先在骨骼肌、大脑、脂肪组织、心脏、肺和胰腺中表达，在免疫细胞中，IL-17D仅在静息CD4+T细胞和CD19+B细胞中表达，因此可能在局部免疫反应中发挥更大的作用[12]。IL-17D拥有202个氨基酸，是IL-17家族中最大的成员，随着研究的不断深入，发现IL-17D有4个半胱氨酸残基参与二硫键的形成。它可能作为一个由两个单体通过二硫键聚合而成的二聚体存在。IL-17D可以通过刺激IL-6、IL-8、GM-CSF等一系列免疫系统相关的细胞因子间接调节免疫反应并放大免疫效应，从而在损伤组织的生长与修复，防御寄生虫感染以及抑制造血功能等方面发挥重要作用。此外，IL-17D可能通过影响固有免疫系统中不同亚型的免疫细胞在肿瘤组织内的募集起到抑制肿瘤生长的作用。

2 IL-17D在脊椎动物中的表达情况

在人类和高等脊椎动物中已经对IL-17进行了大量研究，在哺乳动物中，迄今已分离出六种IL-17家族基因(IL-17A-F),其中IL-17A和IL-17F已被广泛研究。而在鸡等禽类动物及包括鱼类在内的低等脊椎动物中进行的关于IL-17D的研究工作都很少[13]。

2.1鸡 从大肠杆菌感染的2周龄肉鸡的睾丸、法氏囊、脾、胸腺、肺、空肠和肌肉组织中制备总RNA，逆转录合成cDNA后预测鸡IL-17D的氨基酸序列，发现鸡IL-17D与人IL-17D具有64%氨基酸序列同一性，与小鼠IL-17D具有53%氨基酸序列同一性。研究人员发现巨型艾美耳球虫(家禽常见肠道寄生虫，Eimeria maxima)感染后，鸡IL-17D的转录水平在肠上皮内淋巴细胞、法氏囊、肺和脾中增加；同时用IL-17D重组蛋白处理鸡成纤维细胞后IL-6、IL-8的转录水平明显上调。鸡IL-17D刺激促炎细胞因子和趋化因子产生的作用表明它可能是启动、维持以及控制禽类炎症反应的重要可溶性介质，并且在被用作为疫苗佐剂时可能成为提高保护性免疫力的靶标[14]。

2.2鸭 研究人员从健康的鸭大肠中提取总RNA合成cDNA后克隆编码出哺乳动物IL-17D的鸭同源物的全长cDNA，对比分析证明鸭IL-17D与鸡IL-17D的cDNA序列具有约94.7%的同一性，与哺乳动物的同源物具有62.6%～68.4%的同一性。进一步研究发现鸭IL-17D转录物在健康的淋巴组织如脾、胸腺和法氏囊中以相对较低的水平表达，这与鸡IL-17D的表达分布类似。为了明确鸭IL-17D的功能，研究人员用疫里默氏菌(鸭类常见病原菌，Riemerella anatipestifer)肌内感染鸭后发现与未感染的鸭相比，感染鸭肝脏和脾脏中的IL-17D mRNA的水平不变或显著下调以此促进病原性细菌感染期的有效宿主免疫。对于IL-17D在各种病原体感染时的表达差异及其针对这些病原体的具体防御机制还需要进一步调查与评估[15]。

2.3斑马鱼 2006年研究人员在无菌条件下取出斑马鱼(zebrafish)的肠、鳃、脾、肾并分离组织提取总RNA，反转录合成的cDNA作为模板进行PCR,发现斑马鱼体内存在IL-17基因。通过对分离的IL-17基因进行分类，斑马鱼IL-17D与人IL-17D具有52.8%的氨基酸同一性，当比较斑马鱼与其他IL-17基因的核苷酸序列时，IL-17D的核苷酸同一性也被认为是最高的(57.5%)，进一步证明斑马鱼IL-17D是人IL-17D的同源物。为了明确斑马鱼中IL-17D基因表达的定位，通过实时定量PCR(RT-PCR)从正常组织和脂多糖(LPS)刺激的(体外)组织(肠、鳃、脾和肾)分析IL-17D基因的表达情况，发现两种情况下均有IL-17D的表达，说明IL-17D也可能在正常情况下发挥重要作用[16]。

2.4硬骨鱼 采用TRIZOL方法从大西洋鲑鱼(Atlantic salmon)中提取来自肝脏、脾脏、头肾、鳃、胸腺、肠，心脏，皮肤，脑，卵巢和睾丸组织的总RNA。通过RT-PCR检测不同组织中IL-17D的mRNA表达，发现IL-17D广泛分布于所检查的组织中。其中睾丸、卵巢和皮肤中的水平较高，肝脏中的表达水平非常低，这表明各种细胞参与了大西洋鲑鱼IL-17D的产生。尽管IL-17D在主要淋巴器官如头肾(鱼类淋巴组织)和脾相对于皮肤、肠和性腺中表达水平较低，但在腹膜内注射活嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、LPS和β-葡聚糖后，头肾和脾中IL-17D的时间依赖性表达证实了IL-17D可能参与鱼类抗菌免疫防御[17]。

随后，利用人类、斑马鱼和日本河豚(Japanese pufferfish Takifugu rubripes)基因组之间的同线性守恒来鉴定日本河豚IL-17家族基因序列，分析发现河豚IL-17D与人和斑马鱼IL-17D分别具有49%和54.4%的氨基酸同一性。在各种IL-17家族基因中，河豚IL-17D的氨基酸相似性在斑马鱼IL-17D(67.9%)和人IL-17D(64.9%)中最高。之前的实验中发现在斑马鱼和鲑鱼中，LPS刺激均导致IL-17D的表达上调[16,17]。于是在该研究中还检查了鱼中免疫相关组织IL-17家族基因的表达，发现所有IL-17D基因在LPS刺激的头肾组织中显示高水平的表达，说明IL-17D与炎症活动有关[18]。

我们知道RAR相关孤儿受体(RAR-related orphan receptors，RORs)是细胞内转录因子的核受体家族成员，序列对比发现半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的RORα和RORγ与其他硬骨鱼类物种和人类的同源物具有高度同一性。据报道哺乳动物中RORα和RORγ共同协调IL-17A和IL-17F的表达[19]，但对于IL-17D的影响还不明确，为了探究二者在半滑舌鳎中对IL-17D的影响，研究人员通过共转录活性分析发现RORα和RORγ都增加了IL-17D的启动子活性[20]。这一结果说明半滑舌鳎的IL-17D可能受RORα和RORγ的调节进而发挥在免疫系统中的作用，但具体的机制仍需要进一步研究。这一结果也为研究人 IL-17D表达的影响因子提供了一个新的研究方向。

最新的研究是围绕大黄鱼(large yellow croaker or Larimichthys crocea)进行的。嗜水气单胞菌注射后经RT-PCR发现IL-17D表达水平显著上调，鳃中72 h达到峰值，头肾和脾中6 h达到峰值，说明IL-17D在抗菌免疫中的潜在作用。同时，在检查的所有组织中，IL-17D在鳃和皮肤中具有较高的转录水平，鳃和皮肤是黏膜组织，这表明IL-17D可能参与抗病原性入侵的黏膜免疫[21]。在先前的研究中发现草鱼(grass carp or Ctenopharyngodon idella)IL-17D能够促进头肾原代细胞IL-1β、TNF-α等基因表达[22]，并且证实大黄鱼IL-17D也促进上述因子的表达，进一步支持了鱼类IL-17D在宿主防御和促炎症反应等方面的免疫调节功能。

3 IL-17D与B-CLL

B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)是一类起源于造血组织的恶性肿瘤，使用纯化的人IL-17D蛋白对正常人单核骨髓细胞进行集落形成实验，发现IL-17D对骨髓祖细胞具有抑制作用[12],这种抑制作用可能是由于IL-17D诱导抑制性细胞因子IL-8的产生所致[23]。因此研究人员想要了解IL-17D在B-CLL中的作用，把B-CLL患者和健康者的细胞分离后分离蛋白质，通过Western免疫印迹(Western blot)证实患者和健康人的B淋巴细胞和中性粒细胞(PMNs)中都存在IL-17D。进一步研究发现患者PMNs中IL-17D的表达显著升高[24]。一方面，它的存在可以通过诱导IL-6、IL-8和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的产生以及内皮细胞的活化来影响中性粒细胞的募集[12,24]。另一方面，它可以减少TNF-α和IL-12的产生以及中性粒细胞中活性氧的产生。这种变化似乎指出了未来研究的重要方向,同时也给大家提供了一种思路，也许IL-17D在慢性贫血中起作用，其中长期免疫刺激和IL-17D产生增加导致造血功能降低。可能通过诱导释放其他细胞因子，造血的负调节因子直接或间接地在调节造血对炎症的反应中发挥关键作用[23]。

4 IL-17D抑制肿瘤生长

肿瘤免疫编辑是适应性和先天免疫系统控制肿瘤生长和塑造肿瘤免疫原性的过程，包括清除、平衡和逃逸三个阶段。在这一过程中，已经证实来源于野生型(WT)小鼠的低免疫原性编辑过的肿瘤细胞系(称为“进展型”)可以产生肿瘤细胞促进因子，比如GM-CSF、转化生长因子β(TGF-β)、TNF-α等[25,26]。而来自免疫缺陷小鼠的具有高度免疫原性未经编辑的肿瘤细胞系(被称为“回归型”)在肿瘤免疫编辑过程中的作用还没有明确的解释。我们可以认为未经编辑的肿瘤细胞系产生的肿瘤表达因子可以激活宿主肿瘤免疫监视。IL-17D是一种肿瘤细胞表达的细胞因子，它可以通过诱导肿瘤内皮细胞表达趋化因子(CC)2(CCL2或者称MCP-1)募集自然杀伤(NK)细胞到肿瘤微环境中，从而促进M1巨噬细胞发育和抗肿瘤适应性免疫应答[27]。研究人员使用了一种模型系统，通过免疫缺陷型Rag2基因敲除(Rag2-/-)和免疫活性野生型小鼠，由3-甲基胆蒽(3-methylcholanthrene，3-MC)诱导纤维肉瘤，产生高度免疫原性的，未编辑的“回归型”和免疫原性差的，编辑的“进展型”肿瘤细胞系，通过微阵列分析发现与进展型肿瘤细胞相比，IL-17D在回归型细胞中表达和分泌的程度更高。进一步发现与原发性肿瘤相比，转移性人肿瘤样本中IL-17D表达被抑制，表明IL-17D在某些人类癌症中的表达消除了肿瘤进展，并且IL-17D的高表达可能与肿瘤进展呈负相关，在这一过程中，MCP-1和NK细胞对IL-17D的抗肿瘤作用是必需的。这一结论在肺脏肿瘤中得到了验证，即IL-17D上调肺肿瘤组织 NK 细胞含量抑制肿瘤克隆形成[28]。然而，由于IL-17D在编辑的肿瘤细胞中诱导排斥反应，基于IL-17D的治疗可能需要与其他免疫治疗剂联合使用，例如检查点阻滞和(或)调节性T细胞抑制剂[29]。

5 IL-17D与其他因子的关系

核因子 E2 相关因子(nuclear factor erythroid-derived 2-like 2，Nrf2)是氧化应激的主要应答者[30]。人活化Th细胞可能通过诱导Nrf2基因转录来增加Nrf2的表达及活性，同时，Nrf2的诱导增强了Th细胞的氧化还原状态但不影响它们表达炎症因子的能力[31]。我们知道Nrf2可以保护体细胞和癌前细胞免受致癌物质的影响，对肿瘤起抑制作用[32,33]。Nrf2和IL-17D均在原发性肿瘤中以及在体内病毒感染期间被诱导，并且IL-17D在肿瘤和病毒感染的细胞中的表达对于宿主的最佳保护是必需的。经过一系列实验研究发现Nrf2直接与IL-17D启动子区域结合。随后通过检查IL-17D、Nrf2在人和小鼠原代肿瘤中的表达变化，与正常组对比后发现，Nrf2-IL-17D轴在原代肿瘤发生期间被激活，也就是说Nrf2直接诱导IL-17D作为肿瘤抑制因子发挥作用[34]。Seelige等[35]发现腹膜感染鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus，MCMV)的Nrf2-/-小鼠中IL-17D的上调完全被消除，表明Nrf2对于MCMV诱导的IL-17D是必需的。同时发现Nrf2-/-小鼠对MCMV感染的敏感程度高于IL-17D-/-小鼠，这提示Nrf2可能调节其他病毒感染的抗性介质。由于IL-17D可以诱导肿瘤内皮细胞C-C趋化因子受体2(C-C chemokine ligand 2，CCL2)从而募集NK细胞，实验中发现Nrf2-/-小鼠中CCL2的变化并不显著，表明存在着其他机制控制病毒诱导的CCL2表达。Nrf2激活剂叔丁基对苯二酚(Tertiary butylhydroqui-none,tBHQ)在肿瘤中也可以局部诱导IL-17D[26]，但研究人员发现虽然注射tBHQ可以保护WT小鼠免受MCMV感染，但tBHQ同时也激活了独立于Nrf2以外的其他保护途径。类似的情况也出现在小鼠的CCL2中，注射tBHQ在Nrf2-/-和IL-17D-/-小鼠中发现CCL2仍被诱导，说明tBHQ也激活了除Nrf2和IL-17D以外的途径。因此关于Nrf2、IL-17D和这些因子在其他类型的感染以及其他类型肿瘤中的具体参与情况仍然需要研究确定。

6 展望

IL-17家族细胞因子在免疫系统中具有多种功能，不仅可以诱导许多细胞因子和趋化因子的产生，而且在很多自身免疫性疾病中发挥重要作用。其中IL-17D是最古老但也是研究相对较少的，随着对IL-17D日趋深入与广泛的研究，我们发现它在肿瘤和白血病等疾病中的作用至关重要。因此更好地了解IL-17D的表达水平、调节手段、作用方式及它与相关因子之间的关系不仅可以为免疫治疗提供新方法，同时也为其他疾病的深入研究提供新思路。