趋化因子受体CCR7依赖的树突状细胞迁移的调控机制①

程玉洁 刘 娟 (海军军医大学免疫学研究所暨医学免疫学国家重点实验室，上海 200433)

树突状细胞(dendritic cells,DC)是连接天然免疫和获得性免疫的关键桥梁，DC的功能调控决定了免疫应答的整体平衡。DC广泛分布于淋巴及非淋巴组织，它的体内迁移对于其成熟活化及功能调控至关重要[1]。DC体内迁移受到趋化因子及趋化因子受体相互作用的精密调控。趋化因子CCL19/CCL21作用于DC表面的CCR7，引导DC最终迁移到外周免疫器官，对激活T细胞介导的免疫应答及维持免疫耐受都发挥重要作用[2,3]。

稳态情况下，非淋巴组织的未成熟DC(immature DC，imDC)经历自发的成熟过程，形成半成熟DC(semimature DC，smDC)。病原体或炎症信号刺激后，imDC活化为成熟DC(mature DC，mDC)。半成熟DC和mDC上调趋化因子CCR7(C-C chemokine receptor type 7)，在趋化因子CCL19和CCL21(C-C motif chemokine 21)的作用下沿着淋巴管迁移，并穿过被膜下淋巴窦(subcapsular sinus，SCS)，进入引流淋巴结[4,5]。CCL21的另外一个受体为非典型趋化因子受体4(atypical chemokine receptor 4，ACKR4)。ACKR4表达于SCS的内皮细胞表面，与CCL21结合后可以捕获并内吞降解CCL21，从而在淋巴结中形成一个朝向T细胞区CCL21的浓度梯度，最终将DC趋化至T细胞区，进一步激活T细胞介导的获得性免疫应答[6,7]。除外CCR7，其他的趋化因子受体也被证实参与影响DC的体内迁移。如皮肤受过敏原刺激后，CD301b+DC显著上调CCR8并在CD169+SIGN-R1+巨噬细胞分泌的CCL8的刺激下迁移至淋巴组织，继而活化Th2细胞最终激发过敏性免疫应答[8]。本文重点讨论CCR7信号介导的DC迁移及其调控机制。

1 CCR7依赖DC迁移的信号活化机制

CCR7是一种七次跨膜的G蛋白偶联受体，CCL19和CCL21是CCR7仅有的配体，DC通过细胞膜上的CCR7感知淋巴管中的细胞因子浓度梯度而精准定向迁移。有研究表明CCR7对CCL19的反应可能比CCL21的反应时间更短，且只有CCL19可以有效地刺激CCR7磷酸化和内化，导致受体脱敏[9]。体外实验中观察到细胞对低浓度的CCL19和CCL21表现出相似的敏感性，但是当细胞同时暴露于CCL21和CCL19相同梯度甚至相反梯度时，细胞会优先向CCL21方向迁移。这一现象可能与CCL21与基质蛋白多糖和信号紧密结合，不需要内化有关[10]。然而在体内情况下，CCR7如何区分识别CCL19和CCL21来源的趋化信号以调节DC迁移和免疫应答尚不清楚。

CCR7信号活化与蛋白质翻译后修饰(post-translational modification，PTM)密切相关。聚唾液酸化是将多聚唾液酸连接到糖苷上的过程，由多聚唾液酸转移酶ST8Sia Ⅱ和ST8Sia Ⅳ介导。研究表明，St8sia4酶缺失后，小鼠淋巴结体积明显变小，DC迁移能力几乎消失。进一步研究发现，DC的CCR7分子能够携带聚唾液酸，CCL21的C端与唾液酸结合后能够解除其全长的自我抑制，促进CCR7和CCL21有效结合，触发迁移过程和炎症应答[11]。此外，多个胞内蛋白对于促进CCR7介导的迁移信号和适应性免疫活化有重要作用，如磷脂酰肌醇3激酶PI3Kγ(phosphatidylinositol 3-kinase-γ)[12]、糖基磷脂酰肌醇锚蛋白Sema7A(GPI-anchored protein semaphorin 7A)[13]、白三烯C4转运体(leukotriene C4 transporter，MRP1)[14]等。由于CCR7信号活化触发的DC迁移在免疫应答中的关键作用，机体需要复杂的胞内调控机制调节CCR7信号，确保DC受病原体刺激后能够快速动员并到达次级淋巴结，而在迁移后期能够及时“刹车”，以调节免疫活化及免疫耐受的平衡。研究表明，骨架收缩、代谢平衡、表观调控等胞内过程在CCR7信号及DC迁移过程中发挥多样化的调控作用，影响免疫应答的最终效应。

2 CCR7依赖的DC迁移的信号调控机制

2.1骨架收缩 细胞骨架是细胞维持形态、运动、功能的重要成分。骨架收缩不仅提供了细胞运动的原动力，也在多个层面发挥了调控作用。肌球蛋白收缩和肌动蛋白的聚合是细胞迁移的基本特征和动力。肌动蛋白在头部聚集，肌球蛋白在尾部收缩，以维持肌动蛋白的逆流，产生细胞与环境之间的摩擦力，使得细胞朝着头部方向运动，该过程决定了细胞极性和运动的方向[15]。上述机制是免疫细胞迁移过程中骨架重塑的一般性特征，但是DC又有其独特的方式。

imDC在摄取抗原之后成熟活化，形成mDC并携带抗原迁移至淋巴结，进而刺激获得性免疫应答的发生。研究表明，mDC比imDC表达更高水平的CCR7，从而对趋化因子受体CCL19/CCL21的反应性更高。除此之外，细胞内是否存在其他机制导致imDC和mDC对趋化因子的反应方式不同，从而决定imDC和mDC的迁移特征？近期研究表明，imDC的迁移依赖两种肌动蛋白(actin)调节机制，一种是细胞尾部RhoA-mDia1依赖的actin池，用来促进细胞向前运动，一种是细胞头部Cdc42-Arp2/3依赖的actin池，用来抑制细胞迁移但促进抗原摄取。当DC成熟后，Arp2/3依赖的actin明显减少，Rho依赖的actin明显增多，使得mDC降低抗原摄取能力，并快速、持续地往淋巴结迁移[16]。因而，骨架系统能够根据DC的不同成熟状态及需求进行重塑，进而决定其迁移类型。该课题组对该过程的胞内信号基础继续深入探索，发现DC完成摄取抗原刺激后，巨胞饮降低，诱导离子通道蛋白TRPML1(transient receptor potential cation channel,mucolipin subfamily,member 1)表达上调，TRPML1继而诱导溶酶体钙流上升，活化细胞尾部肌动蛋白和肌球蛋白重组，继而促进迁移。溶酶体钙流通过转录因子TFEB诱导TRPML1转录，形成正反馈调节[17]。该研究表明溶酶体信号可以通过调控细胞骨架，促进病原体信号和迁移信号的交叉调节，促进DC高效工作，吞噬抗原后立刻向淋巴结迁移。因而，DC迁移的时机、极性、速度都受到骨架系统的灵活调控。在DC中，尾部的actin聚集可以产生快速的定向迁移，而头部的actin聚集引发的是一种慢速迁移。

2.2代谢调控 代谢作为细胞中一种极为敏感而灵活的反应系统对细胞表型和功能有明显影响。DC表达大量不同类型的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)及细胞因子受体，感知特定的病原体模式分子或环境细胞因子改变，从而诱导炎症反应。不同类型和功能状态下的DC有着十分多样的、动态的代谢特征，以维持细胞能量和物质需求，保证DC的分化和功能稳定[18]。静息状态时，DC主要通过氧化磷酸化和脂肪酸氧化获得能量。在TLR(Toll-like receptors)刺激后，DC短时内迅速上调糖酵解速率并通过活化诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)诱导一氧化氮(NO)的产生而下调氧化磷酸化水平[19,20]。糖酵解的增强不仅为DC活化供能，产生的柠檬酸盐也可以作为体内合成游离脂肪酸的前体，促进高尔基体和内质网的合成以产生和分泌DC活化途径中所需要的蛋白质，这一过程依赖于胞内TBK1/IKKε/Akt通路传递信号[21]。浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)在干扰素诱导剂的作用下氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)和脂肪酸氧化(fatty acid oxidation，FAO)活化上调并产生干扰素发挥抗病毒功能，通过CCR9传递外周抗原的作用在胸腺内诱导免疫耐受的形成[22]。另外，在营养缺乏，乳酸、腺苷等代谢物堆积等情况下，DC会出现一些致耐受的表型，产生TGF-β、IL-10等免疫抑制成分，表达调节性DC(regulatory DC)的特征。此时，腺苷通过诱导AMPK，抑制糖酵解，促进氧化磷酸化，抑制DC活化。

淋巴组织处于低氧环境，而低氧状态对DC分化发育和功能的发挥影响显著。缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1α)与炎症发生发展密切相关[23]。在常氧情况下，缺氧诱导因子HIF-1α被pVHL结合从而发生降解。此时葡萄糖摄入后转化为丙酮酸，因氧气充足，丙酮酸转化为乙酰辅酶A，促进线粒体氧化磷酸化。而缺氧情况下，HIF-1α活化入核，与HIF-1β及p300/CBP形成复合体，诱导糖酵解基因表达，引起糖酵解加强，乳酸堆积。HIF-1α还能够抑制PDH而降低乙酰辅酶A生成，抑制氧化磷酸化，并且促进琥珀酸盐的富集[24]。近期研究表明抑制糖酵解会损害DC树突形状延长、活力的维持、CCR7寡聚和向引流淋巴结迁移的能力。体内实验表明，无论DC受何种因素激活，胞内诱导糖酵解对其迁移运动的支持和CCR7寡聚都是必要的[25]。然而，CCR7信号激活通过何种机制触发DC糖酵解，DC迁移过程中HIF-1α具体发挥了怎样的作用、受到何种调控并影响炎症进展过程尚不清楚。

2.3表观修饰 DC表面模式识别受体快速识别和响应来自入侵病原体或自身受损细胞的信号，活化后触发下游的信号转导，选择性地诱导基因活化或沉默，调控免疫应答的最终效应[26,27]。表观遗传调控包括DNA甲基化、染色质组蛋白翻译后修饰、核小体重塑、非编码RNA等机制，共同调控染色质结构和功能，调节基因表达。组蛋白修饰发生快速且动态可逆，可以在刺激信号到达细胞膜表面几分钟内在染色质上出现继而消失，影响免疫细胞的分化或功能[28]。

在肺脏组织中，cDC前体(pre-cDCs)来源的cDC高表达CCR7并高效介导DC迁移至淋巴结，而单核细胞来源的DC(moDC)细胞膜上表达的CCR7较低，因而moDC难以从肺部迁移至淋巴结，而是在肺脏局部发挥介导过敏和炎症反应的作用。深入研究表明，肺脏cDC和moDC的CCR7表达及趋化功能差异受到表观修饰的调节。cDC和moDC的CCR7基因启动子的H3K27me3(trimethylation of histone 3 lysine 27)水平存在差异。这种CCR7基因表观修饰差异在细胞发育早期尚未形成，而是在单核细胞向moDC分化的过程中逐渐形成的[29]。然而是何种因素导致了组蛋白修饰的改变，该现象的发生是DC对肺脏局部免疫微环境的被动适应，还是谱系分化过程中其他因素导致的主动改变尚无明确答案。此外，组蛋白甲基转移酶Ezh2(methyltransferaseEnhancer of zeste homolog 2)通过对核外骨架结合蛋白(talin)的直接甲基化破坏了其与肌动蛋白的结合从而调控细胞的黏附和迁移[30]。因而，组蛋白修饰酶对于非组蛋白的修饰可能对DC迁移调控也发挥了重要调节作用。

长链非编码RNA(long non coding RNA，lncRNA)是一类具有广泛生物学功能的非编码RNA，通过多种作用机制调控胞内信号，与细胞分化发育、周期调控等众多生命活动密切相关。近年来研究表明，lncRNA在免疫细胞发育和免疫应答过程中发挥着重要的作用。我们的研究发现，lnc RNA Dpf3可以阻碍CCR7依赖的DC的迁移，其机制为Dpf3直接结合HIF-1a并抑制其所诱导的糖酵解功能，调控下游信号转导和蛋白间相互作用[31]。

3 DC迁移与自身免疫性疾病

DC作为天然免疫和获得性免疫的连接桥梁，与自身免疫性疾病及免疫相关性疾病的发生发展密切相关。DC通过参与胸腺T细胞阴性选择，使其获得对自身抗原的耐受从而维持机体多数状态下的免疫稳态[32]。imDC或调节性DC能够诱导T细胞失能或凋亡、促进调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)细胞生成和功能等，维持外周耐受[33]。当免疫稳态被打破，将触发免疫系统针对自身组织或细胞进行免疫应答，诱导自身免疫性疾病的发生[34]。如NF-κB信号一直被认为是促炎相关的核转录因子，近期研究表明该通路中一个重要的活化因子IKKβ对于稳态情况下的DC朝向淋巴结的迁移和聚集有重要作用，能够诱导Treg细胞的分化，促进免疫耐受的形成。敲除IKKβ后，小鼠稳态DC迁移和Treg细胞生成明显降低，自身免疫性疾病发生概率明显上升[35]。

越来越多的研究表明DC迁移紊乱可能导致DC在炎症部位的过度聚集及活化，导致组织过度炎症，甚至引发自身免疫性疾病。CCL19/CCL21被证明与多种自身免疫性疾病如多发性硬化(multiple sclerosis，MS)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)及炎症性肠病(inflammatory bowel diseases，IBD)等的发生发展密切相关。CCL19/CCL21或其受体CCR7的基因缺失小鼠中实验性自身免疫性脑脊髓炎、抗原诱导的关节炎发病明显减弱，且DC介导的Th1及Th17细胞活化显著降低。因此CCL19/CCL21依赖DC迁移及功能活化对于维持免疫应答及免疫调控的动态平衡发挥关键作用。在小鼠实验中，抑制剂FTY720通过减少CCL19分泌和降低DC上CCR7功能显著抑制胶原诱导性关节炎的发生率和严重程度[36]。因此，DC相关趋化因子及趋化因子受体可能成为自身免疫性疾病的潜在诊断标识和治疗靶点。

4 讨论与展望

2011年，诺贝尔生理与医学奖授予了三位在天然免疫领域做出杰出贡献的免疫学家。其中，Steinman等[37]，DC的发现者，在DC的生理功能、临床应用等方面做出了突出贡献。1972年发现DC以来，对DC发育分化、功能调控、临床应用的研究不断取得突破[37]。2010年4月29日，由美国Dendreon公司生产的DC疫苗Provenge成为首个被美国FDA批准正式上市的治疗性肿瘤疫苗，并用于晚期尤其是对激素疗法失效的前列腺癌患者[38]。此外，CCR7在多种肿瘤如乳腺癌、非小细胞肺癌等癌症中表达，这种在免疫细胞和肿瘤细胞中共同表达的特点可能成为DC疫苗肿瘤治疗的新靶点[39]。可以看出，DC的理论和转化医学研究在认识免疫应答根本原理、攻克重大免疫相关疾病中发挥了重要作用。

然而DC领域仍然有许多悬而未决的重要科学问题亟待进一步研究。DC的分类是否可以更加细化、定居外周的DC亚群和迁移性的DC亚群在早期是如何划分的、DC迁移过程是否受到未知代谢物的调控、在稳定状态和炎症状态过程中的DC迁移存在哪些不同，这些领域都等待进一步探究。相信随着研究的深入，以DC为基础的细胞免疫疗法将在自身免疫性疾病、感染性疾病和肿瘤等疾病的治疗与干预中发挥更加重要的作用。