外周血循环肿瘤细胞数目与老年晚期非小细胞肺癌患者疗效及预后的相关性

苟小丽 苑成 柏玉举 石磊 邢时云 马虎

(遵义医科大学 1第一附属医院肿瘤科，贵州 遵义 563000；2第三附属医院)

肺癌是一种威胁人类健康及生命安全的主要恶性肿瘤疾病，非小细胞肺癌(NSCLC)是其常见类型，在全部肺癌患者中占比为75%～80%，现有的根治术、化疗、放射治疗、靶向治疗、生物治疗等手段应用效果均不尽人意，患者5年生存率仍低于20%，肿瘤的远处转移及复发是其治疗失败主要原因〔1，2〕。多数在确诊时已经发展至晚期，只具备姑息放化疗指征，对这类患者的化疗周期制定是临床医生多面临难题，对已经接受多种综合治疗的患者是否还需要维持治疗也是临床医师所要关注的问题。可见早期评估患者治疗情况及预后，对指导患者未来治疗方案的制定意义重大。血行播散是恶性肿瘤转移重要途径，肿瘤细胞入侵血管需要多个步骤，外周血循环肿瘤细胞(CTCs)是存在于转移瘤及原发瘤的进入血流的肿瘤细胞，该肿瘤细胞主要因诊疗操作或自发等原因，通过转移灶或实体瘤释放进入外周循环，从而形成一类细胞〔3，4〕。这类肿瘤细胞多数在进入外周血后，均会在短时间内被机体免疫系统所识别并排除，只有极少部分存活并随血液运行，在合适的时间黏附在血管壁上，侵袭血管壁并进入到组织间质及实质，进行分裂增殖，最终形成转移灶〔5，6〕。由上述论述可以推测外周血CTCs数目可作为晚期NSCLC患者疗效及预后预测评估指标，但目前国内临床与之相关的研究报道并不多见。本研究旨在分析老年晚期NSCLC患者CTCs数目与患者疗效及预后的相关性。

1 资料与方法

1.1纳入对象 在征得遵义医科大学第一、第三附属医院医学伦理委员会批准同意后，选择2016年3月至2018年3月收治的50例晚期NSCLC老年患者作为研究对象，男28例，女22例；年龄60～90〔平均(75.12±8.51)〕岁；肿瘤分期：6例ⅢA期，17例ⅢB期，27例Ⅳ期；病理类型：32例腺癌，17例鳞癌，1例大细胞癌；分化情况：5例高分化癌，18例中分化癌，27例低分化癌。全部患者及其家属对本次研究实施的内容知情并签署知情同意书。

1.2入选标准 (1)纳入标准：①年龄≥60岁；②经组织病理学确诊为NSCLC，并符合《中国晚期原发性肺癌诊治专家共识(2016年版)》〔7〕中晚期NSCLC诊断标准；②符合2009年肺肿瘤TNM分期中ⅢA期、ⅢB期、Ⅳ期诊断标准〔8〕；③全部患者在入组前未接受其他局部抗肿瘤治疗或全身治疗；④患者预计生存时间>3个月；⑤患者入院时心、肝、肾功能检查均正常，血常规检查结果正常，对化疗均可耐受；⑥在院接受至少2个周期的化疗。(2)排除标准：①早期NSCLC患者或入院时已经接受过放射治疗或化疗的患者；②既往有其他恶性肿瘤疾病治疗史者；③合并其他恶性肿瘤疾病者；④无可测量病灶者；⑤治疗依从性差，随访可能小；⑥合并严重心肝肾等其他重要脏器衰竭者或造血系统疾病者；⑦其他对化疗治疗无法耐受者；⑧合并心理疾病或精神障碍等无法很好配合治疗与随访者；⑨治疗前远处转移者。

1.3研究方法

1.3.1治疗方法 全部患者接受多西他赛+顺铂的化疗方案，化疗第1天给予患者多西他赛(正大天晴药业集团股份有限公司，国药准字H20183209)75 mg/m2静滴，静滴时间为1 h；化疗第1～3天给予患者顺铂(贵州汉方制药有限公司，国药准字H20020272)25 mg/m2静滴。以3 w作为1个治疗周期，在持续化疗6个周期后评估疗效，并随访1年，评价并记录患者预后情况(复发情况)。

1.3.2疗效评估标准 全部患者在入院时接受肺部计算机断层扫描(CT)扫描、头部磁共振成像(MRI)、腹部彩超及全身骨扫描，明确疾病分期并评估预后。参照《实体瘤治疗疗效评价标准-RECIST》中相关标准评估疗效〔9〕：①完全缓解：全部目标病灶完全消失，病理淋巴结缩小，各淋巴结短径均低于1 cm，且持续至少4 w；②部分缓解：目标病灶较化疗实施前明显缩小，直径综合较基线减少至少30%，且持续至少4 w；③进展：以全部可测量病灶直径之和最小值作为参照，治疗结束时直径之和相对增加超过20%或直径之和绝对值增加超过5 mm，或有新病灶出现；④稳定：靶病灶变化情况未达到部分缓解，增加的水平也未达到进展，在部分缓解与进展之间。完全缓解+部分缓解=有效。

1.3.3预后评估 随访1年后，检测并观察患者远处转移及死亡情况，将随访发生远处转移或死亡者视为预后不良。

1.3.4外周血CTCs数目检测方法 ①仪器与设备：美国杨森公司提供的血样本储存管、分析仪、孵育装置、循环上皮细胞检测试剂盒、循环细胞质控品试剂盒、缓冲液；德国吊篮式离心机，美国Thermo公司提供试管架、移液管与枪头、涡旋混匀器、去离子水。②试验步骤：分别在化疗前、每化疗2个周期后取患者肘正中静脉采集全血7.5 ml，混匀样本保存，在96 h内进行CTCs的采集与分析。将全血样本离心处理后取上清液，分别向内加入缓冲液及磁颗粒并孵育，处理后吸出磁颗粒移除磁场，加入染色剂标记便于区分，使用细胞分析处理系统处理样本并转移至样本盒内，后进行扫描分析，经免疫富集、荧光标记等方法进行细胞计数。③CTC筛选及分离：白细胞染色为CD45，即白细胞特有抗体；上皮细胞染色为CK，即上皮细胞特有抗体，细胞核染色及DAPI。结合特征识别CTC，系统自动标记并初步筛查，最终经资深病理科医生进行审核与认定。

1.3.5CTCs判定标准 ①较正常细胞拥有更大的细胞体积；②细胞核增大；③细胞核大小变异大，具有多形性特点；④染色质染色有三维层次；⑤核质比增高基本接近1∶1；⑥荧光染色标记为EpCAM+CK+DAPI+CD45+。阳性结果判定：非小细胞肺癌CTCs阳性判定最佳临界值为1个，即7.5 ml外周血中只要发现CTCs均可判定为阳性。

1.4观察指标 治疗结束时观察化疗效果，对比不同治疗效果的患者CTCs数目；将随访1年后远处转移与死亡者作为预后不良组，其他作为预后良好组，对比两组患者CTCs数目；经Spearman相关性分析检验外周血CTCs数目与老年晚期NSCLC患者疗效及预后的相关性。

1.5统计学方法 应用SPSS20.0统计学软件进行χ2检验，相关性分析采用Spearman相关性分析。

2 结 果

2.1疗效 全部50例老年晚期NSCLC患者均接受化疗治疗，在化疗6个周期后，完全缓解、部分缓解、进展、稳定例数分别为1例(2.00%)、15例(30.00%)、9例(18.00%)、25例(50.00%)，有效率为32.00%(16/50)。

2.2随访结果 50例患者化疗期间均无死亡病例，化疗结束随访1年，50例患者中12例发生远处转移，转移率为24.00%，10例死亡，死亡率为20.00%，预后不良22例，占比44.00%；其他28例患者均为预后良好组。

2.3不同治疗效果CTCs阳性检出结果 化疗实施前50例患者基线评估CTCs阳性率为40.00%(20/50)，化疗6个周期后，其CTCs阳性率为26.00%(13/50，安全缓解0例，部分缓解2例，进展8例，稳定3例)，较化疗前显著降低，且化疗后CTCs阳性率多见于病情进展或稳定患者，差异有统计学意义(χ2=20.900,P<0.001)。

2.4不同预后CTCs阳性检出结果 随访1年后，预后不良组患者CTCs阳性率〔40.91%(9/22)〕显著高于预后良好组〔14.29%(4/28)〕，差异有统计学意义(χ2=4.539,P=0.33)。

2.5老年晚期NSCLC患者外周血CTCs阳性率与疗效、预后相关性分析 外周血CTCs阳性率与老年晚期NSCLC患者疗效呈负相关(r=-0.487，P<0.001)，即随着患者CTCs阳性率越高，患者疗效越差。外周血CTCs阳性情况与老年晚期NSCLC患者预后呈负相关(r=-0.301，P=0.333)，即随着CTCs阳性率越高，患者预后越差。

3 讨 论

在全部恶性肿瘤疾病中，肺癌的患病率及死亡率均居榜首，现已成为主要的恶性肿瘤疾病之一，每年新增病例数及死亡人数在全部恶性肿瘤疾病中占比分别为12.7%、18.2%〔10〕。NSCLC是肺癌常见的类型，其早期无典型症状，侵袭能力强，多数患者在确诊时病情已发展为中晚期，甚至部分患者已经发生远处转移，错失最佳的手术机会，这就决定了化疗在晚期NSCLC治疗中的重要地位〔11〕。通常，NSCLC患者对化疗药物敏感度多为中度，化疗的有效率在30%～50%，无病进展期一般为6～9个月〔12〕。

因肿瘤细胞主要经淋巴道及血道转移，故肿瘤的转移复发多与循环内肿瘤细胞有关，故推测化疗结束后监测患者外周血中残余肿瘤细胞可评估其预后。目前，化疗已经成为晚期NSCLC患者基本且重要的治疗手段之一，以铂类为基础的二联化疗方案已成为晚期NSCLC患者标准治疗方案，患者化疗近期效果理想，且毒副反应较其他方案更轻微，患者对化疗方案的耐受性有所提高〔13〕。转移是肿瘤化疗失败主要原因，是一个多步骤、多阶段且复杂的病理过程，由原发瘤或转移瘤脱落肿瘤细胞进入淋巴系统或血流中，后形成CTCs，为恶性肿瘤细胞的转移发展及增殖创造了条件〔14〕。因CTCs来源于肿瘤组织，故其数量在一定程度上可以直接反映晚期NSCLC患者体内肿瘤的负荷情况〔15〕。Xu等〔16〕在2015年使用相关系统对66例NSCLC患者外周血CTCs进行检测，结果显示，阳性率为71.21%，提示外周血CTCs阳性情况可能与患者恶性程度有关。故推测可将外周血CTCs用于老年晚期NSCLC患者化疗效果及预后的评估。RECST实体瘤疗效评估依然是晚期NSCLC患者化疗效果主要评价标准，该标准根据患者局部病灶、远处转移病灶及区域淋巴结变化情况判定效果〔17〕。本研究结果显示，外周血CTCs的动态监测较其他手段用于老年晚期NSCLC患者化疗疗效评估敏感度较高，利于指导患者化疗早期方案的更改，对避免患者承受不必要的过渡治疗或无效治疗意义重大。此外，本研究还观察了老年晚期NSCLC患者外周血CTCs阳性率与预后的相关性。肿瘤的远处转移及患者生存情况均是预后判断重要因子，机体内淋巴通道及循环系统均是肿瘤细胞达到远处器官重要途径，肿瘤细胞需要经过淋巴循环或血液循环才可到达各脏器中定植增殖，从而形成新的病灶，故检测恶性肿瘤疾病患者的循环细胞数目是评估是否发生远处转移的关键〔18〕。本研结果显示外周血CTCs数目的监测可以考虑作为老年晚期NSCLC患者预后的评价指标。因本研究样本量不足，加之受研究时间及研究条件的限制，获得的结果可能存在偏移，得到的结论也可能有其不足，故还应在未来开展大样本、多中心、前瞻性、长时间的研究加以证实。

综上所述，外周血CTCs在老年晚期NSCLC中的表达情况与患者化疗效果、远处转移及死亡风险密切相关，可将外周血CTCs阳性数目与肿瘤标志物联合使用，以为未来老年晚期NSCLC患者的疗效及预后评估提供依据。