中性粒细胞外诱捕网与恶性肿瘤关系的研究进展

胡洋洋，张逸寅，王 华，顾康生

( 安徽医科大学第一附属医院肿瘤内科，安徽 合肥 230022)

中性粒细胞促进肿瘤细胞周期进展和转移潜能[1]。中性粒细胞还可以形成一种网状结构，中性粒细胞外诱捕网(neutrophil extracelluar traps，NETs)通过多种途径参与肿瘤生物学行为。作为一种防御机制，不同于中性粒细胞趋化、吞噬的杀菌方式。NETs是细胞外中性粒细胞来源的DNA网，在炎症信号的作用下释放、诱捕和杀死入侵的病原体，NETs能直接杀死细菌和真菌病原体的程度仍然是有争议的[2]，因为并非所有被困在NETs中的细菌病原体都被杀死了，也没有已知的特定抑制剂可以将NETs的抗菌活性释放出来。自NETs被发现以来，其在多种疾病发展中清除病原体时，直接或间接损伤机体的细胞和组织，已为不争的事实[3]。NETs与多种自身免疫性疾病关系密切，也可在癌症和自身免疫性等无菌炎症条件下形成，并能促进血栓形成。探索NETs与恶性肿瘤的研究领域，明确NETs与恶性肿瘤的关系，势必为肿瘤的预防及治疗提供新的思路。

1 NETs简介

1.1 NETs的结构和形式NETs由组蛋白、染色质DNA、颗粒源性及胞质蛋白等构成，发现这种网状结构参与的病理生理过程可以消除病原体，因此将其命名为NETs。在高分辨率扫描电镜下，NETs是一个特殊的超微结构，是由直径约为15～17 nm的平滑纤维组成。

NETs可分为两种不同的形式，锚定的网和无细胞网，无细胞网被认为是分裂的或像棉花一样的结构，而锚定的网则被描述为线性的、网状的、膜状的或类似于斑点的结构。

1.2 NETosis的代谢过程NETs是肿瘤生长或其他炎症条件作用下的结果，NETosis被特定的刺激物作用而产生，其机理可能更多的是细胞因子环境的副作用，而不是对宿主有益。大量研究集中在是什么刺激物导致了NETs的形成，以便在消极影响大于积极影响的情况下将其作为治疗靶点。研究表明，病原微生物、干扰素、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)、活化的血小板、促炎分子HMGB1、缺氧、全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)等均可刺激中性粒细胞产生NETs。

中性粒细胞活化后形成NETosis是一种全新的细胞免疫应答方式。NETs是通过两种途径形成：一是细胞死亡途径，称为NETosis，它始于核分裂和核包膜的解体，并继续失去细胞极化，染色质反分裂和血浆膜破裂。二是非NETosis式，它可以独立于细胞死亡而发生。并涉及到核染色质的分泌，伴随着颗粒蛋白通过脱粒的释放。这些成分在细胞外聚集并留下活跃的无核细胞持续摄取微生物。

2 NETs与恶性肿瘤的关系

2.1 NETs与恶性肿瘤关系的概述中性粒细胞通过多种机制影响恶性肿瘤生物学行为，并且有证据证明NETs的存在[4]。NETs 在多种恶性肿瘤组织中高表达，且肿瘤具有调节NETs的系统效应。已发现胃、肠、肝、胰腺肿瘤发生与NETs形成有关。与肿瘤相关的有两种中性粒细胞表型，抗肿瘤N1和致瘤性N2中性粒细胞，N1和N2中性粒细胞都能产生NETs。然而，它们的功能可能有所不同，其在血管生成和组织生长与组织损伤方面的作用仍然是谜。尽管假定中性粒细胞会对N1或N2型显型进行极化，但具体条件尚不清楚。此外，这些中性粒细胞可以激活CD8+T细胞和树突状细胞，甚至可以激活肿瘤抗原。瓜氨酸化组蛋白H3(citrullinated histone H3；H3Cit)是NETs的中心分子[5]。对肿瘤患者中性粒细胞表型的分析显示，H3Cit阳性的中性粒细胞比例较高。恶性肿瘤中，高表达的循环H3Cit提示较差的预后，短期死亡风险较低表达患者增加了2倍。H3Cit可以作为一种晚期癌症患者相关炎症标志物[5]。肿瘤细胞中的PAD4介导的瓜氨酸化诱导染色质去致密化，对中性粒细胞在生理条件下形成NETs有重要作用[6]。

2013年，Cools-Lartigue等[7]报道了在静态和动态条件下循环肿瘤细胞在体外被NETs捕获。这些效应被脱氧核糖核酸酶Ⅰ(deoxyribonueleaseⅠ，DNaseⅠ)或中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的NETs抑制所消除。这些发现表明，在全身感染的背景下，NETs参与了癌症转移过程，NETs可能作为潜在的治疗靶点。

2.2 NETs与肿瘤微环境密切相关NETs与恶性肿瘤的关系与复杂的肿瘤微环境密切相关。粒细胞集落刺激因子刺激肿瘤细胞转移在许多临床模型中已被证实，这反过来又增加了系统的NETosis。已证明，NETs能够捕获循环肿瘤细胞(CTCs)，并对远处的器官产生二次附着力。肿瘤细胞与NETs的关系与β1-整合素密切相关[8]。β1-整合素表达在肿瘤微环境炎症的背景下产生是增加的。给小鼠注射DNAse 1时，这种效应则消失。对NETs的整合抑制可以降低体内的肝癌细胞粘附性。需要指出的是，通过抗体或siRNA抑制β1整合素并不能完全抑制癌细胞对NETs的粘附。因为NETs实际上是由数百种蛋白质修饰的，其中许多蛋白质可能也会导致癌细胞粘附和肿瘤发生，而β1整合蛋白可能只是被认可的参与者之一。对中性粒细胞弹性蛋白酶的药理学抑制作用降低了癌细胞在体内的转移潜能，这是对中性粒细胞弹性蛋白酶敲除动物实验结果的总结[7]。然而，转移的明显减少，可能是由于NETs形成减少。事实上，有研究表明，NETs与转移瘤的发生有关。NETs和中性粒细胞弹力酶的作用难以区分。此外，通过其他方式靶向NETs，如DNaseⅠ或肽酰基精氨酸脱砸氨酶4抑制剂，同样可以减少肺和肝的转移，尤其是在炎症应激增强的情况下。总之，这些研究结果证实，在复杂的肿瘤微环境中，恶性肿瘤与NETs的关系可能存在复杂交错的相互作用。

2.3 NETs在肿瘤发生发展中的作用NETs参与肿瘤诱导的全身效应。原发性肿瘤细胞可表达G-CSF等因子，诱导全身性血管内NETs形成；网作为血小板粘附、活化和聚集的支架，可促进血栓形成[9]；NETs通过隔离循环肿瘤细胞[7]，增强肿瘤细胞对内皮的粘附， 也可能通过增加肿瘤细胞的渗出，促进转移；肿瘤诱导的网状血管闭塞导致远端器官灌注不足和炎症，损害远处器官的血管功能，可能是器官衰竭的原因之一。

NETs会以多种方式促进原发肿瘤的生长。粘附分子与中性粒细胞介导的炎症反应之间有密切关系。中性粒细胞形成的因子可以支持肿瘤在转移级联的每一步发展，包括早期粘连、增殖、侵袭和血管生成。其中许多因素已在内部得到证实。像NE这样的介质释放可以促进肿瘤的生长和进展以及肿瘤细胞的迁移。血管生成可以通过白细胞介素-8直接刺激，也可以通过MMP9触发的细胞外基质释放血管内皮生长因子。此外，NETs本身可以导致额外的中性粒细胞的增加，从而引发炎症反应。NETs可能代表了各种嗜中性粒细胞衍生因子在肿瘤生物学上发挥作用[10]，通过这种方式支持肿瘤细胞增殖。NETs可能为困在丰富蛋白质中的肿瘤细胞创造一个有利的肿瘤微环境。

Kanamaru等[11]研究发现，腹腔手术后，NETs捕获播散性的肿瘤细胞，在肝脏中大量形成微转移酶，为肿瘤细胞存活提供有利的微环境。术后腹膜后灌洗液中含有许多低密度中性粒细胞(LDN)，且具有成熟的显型，为NETs的形成提供了充足的原材料。反过来肿瘤细胞有选择性地附着在NETs上并在LDN单层细胞上增殖，NETs可以调节肿瘤细胞的附着力并促进腹膜转移。

Tohme等[12]在体外机制研究表明，小鼠中性粒细胞来源的NETs可触发高迁移率族蛋白B1的释放，激活癌细胞tlr9依赖的通路，促进其黏附、增殖、迁移和侵袭。DNAseI和PAD4可以抑制由手术应激引起的NETs炎症性风暴以减少转移，提示清除NETs可降低肿瘤复发的风险。

2013年，Berger-Achituv[13]首次表明尤文氏肉瘤患者TANs可以被激活诱导NETs。课题组这次在对尤文氏肉瘤进行的一项小型研究中，25%的转移病例检测到NETs,这些患者并较早出现了转移，表明NETs可能促进肿瘤的进展，这是国际上第一次报道的NETs相关临床研究。人体肺癌组织和骨肉瘤组织中均存在中性粒细胞坏死和NETs 结构，并且与治疗疗效及预后密切相关。肺肿瘤中的NETs增加血管的通透性，帮助肿瘤细胞从脉管系统中渗出，促进肿瘤的播散。

Park等发现转移性乳腺癌细胞可以诱导中性粒细胞在没有感染的情况下形成NETs。利用活体成像技术，Park等还观察到了转移到小鼠肺部的4T1癌细胞周围的网状结构，并可用DNase I阻断。Richardson等[14]实验结果显示，与健康对照组相比，结直肠癌患者的NETs产量显著增加，研究还表明，不良的患者预后，即术后并发症和死亡率，都与术前NETs产生增加有关。弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者晚期的NETs水平升高，并与生存率降低相关[15]。在本模型中，阻断NETs、阻断IL-8-CXCR2轴或抑制TLR9可以延缓肿瘤进展。Abdol等[16]研究证实胰腺癌细胞可以独立于ROS的产生，刺激NETs的快速释放，胰腺癌诱导的NETs是导致患者静脉血栓形成的高风险因素。并通过 DNase I降低细胞外DNA和CXCL8表达的水平，抑制了胰腺癌的转移，这项研究又是支持NETs的破坏可以减少癌症的转移一例子。

2018年，Albrengues等[17]证实持续的肺部炎症后，NETs可以促进休眠癌细胞的觉醒。 NETs通过将中性粒细胞蛋白酶集中于细胞外基质蛋白，从而唤醒肿瘤细胞，允许层粘连蛋白的顺序水解重构，并导致整合素介导的癌细胞信号传导。

2.4 NETs抑制相关研究2016年，Arelaki等[18]的实验数据显示NETs通过诱导癌细胞凋亡来抑制结肠癌细胞的体外生长。发现中性粒细胞和网状物随着距离肿瘤的距离成比例地减少，是肿瘤微环境中TF的重要来源。

Millrud等[19]体外实验显示，头颈部鳞癌中CD16hCD62Ld中性粒细胞亚型高比例的存在，通过NETs诱导细胞凋亡、抑制增殖从而阻碍癌细胞生长。此外，CD16hCD62Ld中性粒细胞亚型比例的增加与存活率的增加有关。

3 NETs与肿瘤性相关血栓形成

无论接受化疗与否，都有很高比例的癌症患者会出现致命的血栓并发症。自2010年首次观察到NETs在DVT中的存在以来，明确网状结构是深静脉血栓的一部分[20]。在乳腺癌、非小细胞肺癌中，中性粒细胞更容易形成 NETs 结构，从而导致肿瘤相关的血栓形成。口腔鳞状细胞癌(OSCC)患者中性粒细胞NETs的释放增强口腔鳞状细胞癌患者的促凝活性，从而使其处于高凝状态[21]。

NETs产生的凝血活性可以促进癌症的生长。从荷瘤小鼠中分离出的中性粒细胞易形成NETosis。肿瘤分泌细胞因子，如粒细胞集落刺激因子，系统地启动中性粒细胞。NETs升高为癌症相关血栓形成提供了一种新的解释，如血浆H3Cit等NETs生物标志物水平较高的小鼠显示自发性血栓形成[20]。

高凝是促进肿瘤恶化和增加血栓风险的常见加重因素。GC中性粒细胞释放的NETs增加了控制血浆产生凝血素和纤维蛋白的能力。这些促凝剂效果由于DNaseI的应用效果降低。进一步发现，在GC患者中自发形成的网状结构明显高于健康对照组，促进了肿瘤-淋巴结转移，与血栓-抗凝血酶复合水平和D-二聚体呈正相关。另外，DNase I对纤维蛋白的无细胞血浆生成的影响取决于NETs形成的浓度。

肠道肿瘤会破坏肠道屏障，使LPS渗入血液循环。通过激活替代补充途径，LPS将中性粒细胞转变为NETosis，从而促进凝血，这些发现提供了一种机械联系在癌症与血栓风险之间。在胃肠道系统中，已发现胃、肠、肝、胰腺肿瘤发生与NETs血栓形成有关。

4 NETs作为肿瘤药理学靶点的研究

NETs抑制恶性肿瘤的报道相对较少。而NETs 与肿瘤细胞锚定粘附、增殖、远处转移肿瘤，相关性血栓形成的研究以及作为治疗靶点的研究则是聚焦的热点。其中比较明确的有，降解或抑制 NETs 的药物，如 DNase 或 NE、 PAD4 抑制剂，在肿瘤相关性疾病中具有潜在的治疗作用。这将成为抗肿瘤的一个新的靶点，此领域研究进展已有相关报道。此外降低NETs的表达对肿瘤外的疾病也大量相关报道。肽链精氨酸脱亚胺酶4(PADI 4)是NETs过程中最关键的一步。因此，研究人员敲除了胰腺癌小鼠体内的Padi4基因，敲除后的胰腺癌小鼠较没有敲除基因的对照组小鼠中位生存期明显提高[22]；体外研究证实，NETs促进血栓形成的静脉剪切应力[12]；在人类和小鼠中，NETs聚集物在胰腺导管内形成，阻塞胰腺导管，从而引起胰腺炎症。故阻止聚集性NETs形成聚集，可限制其自身诱导的炎症反应[23]；曾在一项随机对照的试验中用于自身免疫性系统性红斑狼疮患者。rhDNAse给药耐受性良好，无明显不良反应。DNAse在干预围手术期的应用可以降低转移性肿瘤切除术患者的复发风险。此研究表明利用DNA酶抑制NETs具有临床应用前景[24]；下调NETs的表达可能有效延缓动脉粥样硬化斑块进展[25]；如在HCC患者中，随着MELD评分的升高，NETs标志物水平逐渐升高，提示NETs含量与肝脏疾病严重程度呈正相关。抑制NETs的药物治疗手段有望用于管理HCC患者PVT；如体外研究发现，充足DNAse可加速急性冠状动脉综合征时组织型纤溶酶原激活剂(tPA)诱导的溶栓，而DNAse本身则无此作用。

5 结语与展望

总的来说，这些发现强烈建议将NETs作为一种潜在的药物治疗靶点。阻止该网络的形成，可有效减少癌细胞的转移。潜在的抑制剂将成为NETs在免疫学、肿瘤、心血管、炎症等领域治疗过程中重要的发展方向。预防或清除NETosis的策略已经确定，今后的相关临床发展值得关注。