探究水涝胁迫下欧李过氧化氢与多酚氧化酶的变化

( 1.定襄县国有林场,山西 忻州 035400;2.太谷县农业农村局,山西 晋中 030800)

欧李(Cerasushumilis),蔷薇科樱桃亚属的一种抗寒、抗旱、耐盐碱、耐瘠薄、适应性强的野生果树,是我国特有的树种,主要分布在中西部地区的山西、河北、陕西、内蒙和东北地区[1-2]。其植株较小,株高仅0.5～1 m,枝条细密,叶芽密集,花白色或粉色。结果早,果似樱桃,味似李子,酸甜适口。欧李果实中含有各种对人体有益的矿质元素,尤其是钙元素的含量比一般的水果都高,因而便有了‘钙果’[3]之称。欧李经济价值极高,用途非常广泛。果树在绿化美化环境、治理荒山沙漠、防治水土流失方面具有特殊的效果,被国家林业局列为生态林优良树种。果肉可食,仁可入药,茎可作饲料和编织材料,其开发利用前景非常广阔。

水涝胁迫对植物产生的危害被称为涝害,使得植物细胞内自由基平衡招遭到破坏。随着水涝程度的加深,细胞内的活性氧大量积累,会使过氧化氢迅速产生,过氧化氢可以直接或间接地氧化细胞核酸、蛋白质等生物大分子,造成细胞膜系统的损害,严重时会导致植物细胞死亡[6]。而多酚氧化酶(polyphenoloxidase,PPO)是植物体内普遍存在的一类铜结合酶,与植物抗逆作用有极大的关系。衰老、逆境胁迫以及病原菌、病虫侵害都能引起PPO活性的变化[7]。因此本实验通过测定欧李在水涝胁迫下的过氧化氢与多酚氧化酶活性的变化,进一步了解欧李在水涝情况下的生长机制,分析其原因,为探讨欧李植物的抗逆性提供理论依据。

1 试验材料、试剂与仪器

1.1 植物材料

欧李选自成都大学种植基地,取8株(2株备用)长势良好的欧李植株,将其放置于室内正常培养。首先采用双套盆法对3株植株进行水涝胁迫处理,使水位淹没至植株根茎处。另外3株作为对照组,在正常条件下培养,不做任何处理。

1.2 试验试剂

pH5.9的0.05 mol/L磷酸缓冲液:取Na2HPO40.8903 g, NaH2PO46.3734 g,将以上试剂溶解于800 mL蒸馏水,定容至1 L;20%的三氯乙酸溶液:称取20 g三氯乙酸,溶解于100 mL蒸馏水中;0.1 mol/L的邻苯二酚溶液:称取1.1011 g邻苯二酚,溶解于蒸馏水中,定溶至100 mL;10 μmol/LH2O2丙酮试剂:取30%分析纯H2O257 μL,溶于100 mL丙酮中;还有2 mol/L硫酸、5%(W/V)硫酸钛、浓氨水、石英砂等试剂均为分析纯。

1.3 仪器

CT15RT型高速冷冻离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司);7200 型可见光分光光度仪(尤尼柯上海仪器有限公司);FA2004B型电子天平(上海越平科学仪器有限公司);DB-210SCB型电热鼓风干燥箱(成都天宇试验设备有限责任公司);冰箱(海尔);移液管(5 mL、2 mL、1 mL);移液枪(250 μL);离心管(5 mL)8支;容量瓶;烧杯;研钵;剪刀;洗耳球。

2 试验方法

2.1 过氧化氢测定

2.1.1 过氧化氢标准曲线制作

实验参考汤绍虎,罗充主编的《植物生理学实验技术教程》的方法[8],取5 mL离心管7支,依顺序编号,并按表1加入试剂。待沉淀完全溶解后,将其小心转入5 mL容量瓶中,并用蒸馏水少量多次冲洗离心管,将洗涤液合并后定容到5 mL,然后415 nm波长下测定吸光度。

表1 测定H2O2浓度标准曲线加样表

2.1.2 过氧化氢提取测定

取植物当年生枝条上的叶片,洗净擦干并称重,用剪刀将其剪碎,然后置于预冷的研钵中,加入少量石英砂,再加入少量液氮将其研磨成细小的粉末,然后转移到5 mL刻度离心试管,按材料与提取剂1∶1的比例加入4 ℃下预冷的丙酮,将研钵用少量的丙酮分3次洗净,清洗液合并入上述离心管中,放入高速离心机中,在4 ℃3 000 r/min下离心15 min,弃去滤渣,上清液即为过氧化氢提取液。用移液管吸取样品提取液1 mL，按表1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后5 000 rpm/min离心10 min，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。向洗涤后的沉淀中加入2 mol硫酸5 mL，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色，按表1测定其吸光度。

2.1.3 过氧化氢计算公式

式中C——标准曲线上查得样品中H2O2浓度(μmol);

V——测定时用样品提取液体积(mL);

Vt——样品提取液总体积(mL);

FW——植物组织鲜重(g)。

2.2 多酚氧化酶测定

2.2.1 多酚氧化酶粗酶液的制备与测定

取植物当年生枝条上的叶片，洗净擦干，称重,用剪刀将其剪碎,然后置于预冷的研钵中,加入少量石英砂,再加入0.5 g不溶性聚乙烯吡咯烷酮和pH5.9缓冲溶液,冰浴研磨成匀浆。将匀浆全部转入离心管中,于4 ℃10 000 r/min离心10 min,取上清液即为粗酶液。另取一试管中加入3.9 mL 0.05 mol/L pH5.9的磷酸缓冲液、1.0 mL 0.1 mol/L的邻苯二酚溶液,在37 ℃恒温水浴中保温2 min,然后加入0.1 mL粗提液,迅速摇匀。在37 ℃恒温水浴中反应10 min后,迅速取出试管放置在冰浴中,并加入2 mL 20%三氯乙酸溶液终止反应。在5 000 r/min下离心10 min,取上清液于525 nm波长处以时间扫描方式,在1～5 min内测定吸光度变化。

2.2.2 多酚氧化酶计算公式

式中U——酶活性(U);

ΔA——吸光度变化;

m——叶片质量(g);

t——反应时间(min);

D——酶液稀释倍数。

3 结果与分析

3.1 过氧化氢测定结果分析

3.1.1 过氧化氢标准曲线

根据表1的方法得到的过氧化氢标准曲线为y=0.2 782x-0.0 005,R2=0.9 994。根据吸光度值制作出的过氧化氢浓度标准曲线如图1,过氧化氢浓度与吸光度间线性关系良好,可以用于后续过氧化氢含量的测定。

3.1.2 过氧化氢含量的变化

测欧李在水淹168 h过程中过氧化氢含量的变化,一个实验组和一个对照组,每天早上9-11时取样,每隔24 h测1次,每组做3个平行,来研究水涝下欧李叶片中过氧化氢含量的变化,得到的数据见表2、表3和图2。实验组与对照组的变化趋势基本相同,实验组的过氧化氢的含量略高于对照组,而在后72 h里都是先增后减。说明欧李在受到水涝胁迫24 h后,过氧化氢浓度较高,而24～96 h里,植物受到胁迫后体内会生成很多抗氧化酶类并保持较高的活性,可以清除多余的氧自由基,使得过氧化氢含量逐渐减少。而100～140 h里过氧化氢突然升高,又下降,可能是由于100～140 h时天气温度的突然升高,使得欧李又受到了高温胁迫所导致的,140 h后是由于体内的抗氧化系统的增强来抵御胁迫所引起过氧化氢含量的下降。

表2 实验组测量数据

表3 对照组测量数据

3.2 多酚氧化酶测定结果分析

根据PPO活性计算公式,计算168 h内酶活性变化,得到图3中所示的水涝胁迫组与对照组酶活性变化对比图。其中对照组前144 h内,PPO活性持续下降,和培养天数呈现明显的负相关性,并在120 h时达到最低值36.59,而144～168 h内,PPO的活性极速上升,而且幅度较大,在168 h时达到最大74.69,基本上达到实验开始时的酶活。而水涝胁迫组前144 h内,PPO活性趋于平稳,且非常接近对照组PPO活性的最低值36.59,对其进行显著性差异分析发现P>0.05,所以水涝胁迫组PPO活性与对照组最低PPO活性值无明显差异。而144～168 h内,变化趋势也与对照组相同,PPO活性迅速增加,在168 h达到最大值62.54,完全高于前144 h内的酶活性水平。观察两组数据发现,对照组PPO活性到达拐点的过程是缓慢呈线性下降的,而水涝胁迫组则是从开始就急速降低至最低值,并且在此期间保持基本稳定。PPO活性与光合作用效率密切相关,对照组通过抑制光反应,间接影响暗反应速率,所以造成缓慢下降的态势;水涝胁迫组直接抑制暗反应的进行,因此,PPO活性的变化相比对照组更加直接和快速。而在144 h后PPO活性突然升高,是由于光合作用所产生的营养成份无法满足植物需求时,植物就会产生对弱光的抗逆反应。植物通过提升PPO的含量,提高了光合作用电子传递链传递电子的效率,从而提高了光合作用效率,一定程度上保护了植物的生长。通过比对两组数据,发现二者之间的差异不明显,PPO活性上升时间,上升幅度基本相同。因此短时间的水涝胁迫不会对欧李的生长造成太大的影响。

4 结论

欧李是一种具有庞大的根群,植株繁茂,具有固沙、抗蝗、耐旱、耐寒、耐盐碱等减灾功能的优良树种。不论从水土保持、荒漠化治理、退耕还林,还是干旱、半干旱区域生态修复等方面来看,在成都地区引种欧李都具有极大的生态价值和经济价值[9-10]。成都地区属于亚热带湿润季风气候,如果要将欧李引入,就必须考虑水涝胁迫对欧李生长可能造成的影响。本研究就通过观察欧李受到水涝胁迫后的过氧化氢的含量和多酚氧化酶活性的变化,发现水涝胁迫组的过氧化氢含量高于对照组,但增加不显著且变化趋势基本一致;再从多酚氧化酶的变化情况来看,水涝胁迫组前144 h内,由于植株受到水涝胁迫,气孔关闭且光照减少,严重影响了光合作用速率导致了PPO活性的降低,但最低值与对照组基本一致,且变化不显著,而144 h后对照组与胁迫组的PPO活性都显著增加且趋势一致。综合过氧化氢含量和多酚氧化酶分析发现,短时间内,欧李对水涝胁迫有较好的耐受性,为欧李引种成都种植奠定了理论基础。