玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素纳米颗粒的制备与抗氧化特性

邓卓丹，陈文学，兰思琪，陈卫军，陈海明

(海南大学 食品科学与工程学院，海南 海口，570228)

槲皮素(3,3′,4′,5,7-五羟基黄酮)是一种天然黄酮醇，它具有多种生物活性，除了能抗致癌、抗菌和抗病毒外，也是最有效的抗氧化剂之一[1-3]。流行病学研究表明，经常食用富含槲皮素的食物可能降低心血管损害和癌症风险[4]。然而，日常饮食不能提供足够量的槲皮素，因此需要制备增强槲皮素的食物或相关补品[5]。但由于其有限的水溶性和低稳定性，限制了其在亲水性食品系统中的应用[6]。

玉米醇溶蛋白是玉米中的主要贮藏蛋白，玉米醇溶蛋白中超过50%的氨基酸残基是疏水性的，可溶于乙醇水溶液(60%～90%)，但不溶于水[7]，根据其高度疏水性，玉米醇溶蛋白可以通过反溶剂沉淀法(antisolvent precipitation, ASP)转化为球形胶体纳米粒子，这使得它特别适合于递送功能性组分[8]。在过去的几十年中，玉米醇溶蛋白被广泛用于制造包埋功能性成分的纳米粒子，如叶黄素[9]、姜黄素[10]等。但玉米醇溶蛋白纳米粒子的包封效率低，可将玉米醇溶蛋白核与生物聚合物壳组成复合胶体颗粒，用ASP法制备，以改善玉米醇溶蛋白纳米颗粒的物理稳定性和功能特性。一些小分子表面活性剂可以通过降低表面疏水性，增加静电来防止玉米醇溶蛋白纳米粒子的聚集和空间排斥。有研究表明玉米醇溶蛋白和硬脂酸钠复合物通过非特异性疏水吸引，改善了玉米醇溶蛋白的溶解度、扩散迁移率和界面负荷[11]。以玉米醇溶蛋白作为载体的复合纳米粒子用于递送生物活性成分将具有较大的潜力。

卵磷脂被认为是一种安全且生物相容性优良的赋形剂，并已广泛应用于食品、制药和化妆品等行业。它由脂肪酸和磷酸酯基酯化的甘油骨架组成，最近有报道称，基于卵磷脂的胶体递送系统可能是生物活性成分的合适载体。研究证实卵磷脂可以在乙醇水溶液中与玉米醇溶蛋白相互作用，形成稳定的复合胶体纳米颗粒[12]。

本研究将比较分析用ASP法制备得到的不同比例的玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素纳米颗粒的稳定性及其抗氧化能力，以期开发出用于功能性食品和药物的槲皮素纳米输送系统。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米醇溶蛋白，上海麦克林生化科技有限公司；卵磷脂、槲皮素，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；NaOH、HCl、无水乙醇,均为分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

AR124CN电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司；FE20型pH计，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；HSJ系列恒温水浴搅拌器，江苏科析仪器有限公司；SHZ-D(III)型循环水真空泵、RE-5298型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；TU1810型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；Christ Alpha1型冷冻干燥机，德国Marin Christ公司。

1.3 实验方法

1.3.1 纳米颗粒制备

将1.0 g玉米醇溶蛋白溶解在100 mL 70%(体积分数)乙醇水溶液中，磁力搅拌2 h。加入不同量的卵磷脂，使玉米醇溶蛋白与卵磷脂的质量比分别为1∶0、 0∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、2∶3和1∶2，搅拌3 h。然后将0.1 g槲皮素加入到玉米醇溶蛋白-卵磷脂溶液中并磁力搅拌1 h，把20 mL玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素乙醇水溶液加入到60 mL去离子水中，磁力搅拌30 min。残留在分散体中的乙醇通过旋转蒸发器在45 ℃条件下蒸发。使用0.1 mol/L HCl或NaOH将分散体调节至pH 4.0后,2 000 r/min离心20 min以除去大颗粒和游离的槲皮素。最后，将分散体在4 ℃的冰箱中储存以进一步分析，并将部分分散体冷冻干燥48 h获得干燥颗粒。

1.3.2 包埋和装载效率

用无水乙醇稀释玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素纳米颗粒分散体，当乙醇浓度达到80%(体积分数)后进行超声波处理(超声比100%，80 Hz，15 min)，以80%乙醇作为空白对照，在373 nm下测定样品的吸光值，绘制浓度标准曲线方程：y=0.015+0.023,R2=0.996，包埋率(EE)和载量率(LE)通过以下公式(1)和(2)计算：

(1)

(2)

1.3.3 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素纳米颗粒分散体的稳定性

测定不同比例下纳米颗粒粒径、电位、多分散系数(polydivercity coefficient, PDI)情况。将新鲜制备纳米水分散体用蒸馏水稀释20倍,分散均匀后取1 mL放入样品池进行测定。

1.3.4 傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)

将干燥的纳米颗粒与KBr以1∶100的比例混合于玛瑙研钵中，研磨混匀，压片后制成透明薄片，放置红外光谱仪中于4 cm-1的分辨率从4 000～400 cm-1进行频率扫描。

1.3.5 差示扫描量热法测量(differential scanning calorimetry, DSC)

研究纯槲皮素和不同质量比下玉米醇溶蛋白与卵磷脂的纳米颗粒的热学特性。将5 mg冷冻干燥的样品在标准铝盘中称重并密封，以10 ℃/min的恒定速率从30～200 ℃加热,使用空的密封铝盘作为参考，同时用干燥氮气以50 mL/min的速率恒定吹扫。

1.3.6 扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)

观察冻干样品的微观形态。在观察之前，用IB-5型离子溅射仪喷金镀膜以避免在电子束下充电，对不同纳米颗粒进行微观结构观察。

1.3.7 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素纳米颗粒分散液的抗氧化特性

(1)DPPH自由基清除活性

称取0.002 g的DPPH粉末溶于25 mL无水甲醇中，测得溶液的吸光值A517在1.2～1.3范围内，然后以此溶液与样品溶液4∶1(V∶V)的比例加入具塞试管中，将混合溶液充分混匀并放置于30 ℃水浴锅中恒温避光加热45 min，以甲醇为对照组，Vc作为标准对照，在吸收波长为517 nm处测得样品DPPH的自由基清除能力,根据公式(3)计算[13]：

(3)

式中，A0，对照组甲醇的吸光值;A1，样品的吸光值。

(2)总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)

根据总抗氧化能力(TAOC)测定试剂盒(货号A015)操作步骤进行操作，以蒸馏水调零，Vc作为标准对照，在520nm处测定各管的吸光值，计算公式如下所示：

(4)

1.3.8 数据处理与统计分析

所有试验测定3次,采用Origin 2018软件对试验数据进行单因素显著性方差分析与绘图，通过Duncan’s多重比较检验(P<0.05)分析方法计算样品的平均值±标准差。

2 结果与讨论

2.1 玉米醇溶蛋白-卵磷脂纳米颗粒对槲皮素的包埋特性

在表1中，单一玉米醇溶蛋白和卵磷脂纳米颗粒中的槲皮素的包封率分别为58.7%和37.4%。随着卵磷脂比例的增加，包封率逐渐增加，表明了槲皮素、玉米醇溶蛋白和卵磷脂之间的相互作用(静电吸引、氢键和疏水效应)提高了颗粒的包埋能力。在玉米醇溶蛋白与卵磷脂质量比为1∶2时，复合纳米颗粒的包埋率增强至73.2%，显示出更好的包封容量。当玉米醇溶蛋白与卵磷脂质量比从1∶0变为2∶1时，槲皮素在玉米醇溶蛋白-卵磷脂复合纳米粒子中的包里率逐渐增强。继续增加卵磷脂含量，玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素复合纳米颗粒的负载率降低，归因于负载率是包封的槲皮素与玉米醇溶蛋白-卵磷脂总质量的质量比。卵磷脂的存在可以显著提高复合纳米颗粒的包埋能力，并且玉米醇溶蛋白和卵磷脂之间可能存在增强槲皮素包埋率的协同作用。

表1 不同玉米醇溶蛋白-卵磷脂质量比下的槲皮素包封率及负载率 单位：%Table 1 Quercetin encapsulation and loading efficiency under different the mass ratio of m(zein)∶m(lecithin)

注：同一列不同小写字母表示具有显著性差异，下同。

2.2 傅里叶变换红外光谱分析

通过FTIR表征玉米醇溶蛋白，卵磷脂和槲皮素之间的分子相互作用，如图1所示。

1∶0、1∶2、2∶3、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1为玉米醇溶蛋白和卵磷脂质量比，下同。图1 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素纳米颗粒的FTIR图Fig.1 FTIR of zein-lecithin-quercetin nanoparticles

2.3 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素纳米颗粒的热稳定性

通过DSC测定样品中生物活性化合物的物理状态变化。从图2可以看出，槲皮素的DSC曲线在119 ℃附近显示有尖锐的吸热峰，这归因于槲皮素晶体的熔化并且表明存在结晶态的槲皮素。

图2 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素纳米颗粒的DSC图Fig.2 DSC chart of zein-lecithin-quercetin nanoparticles

表2中给出了不同比例复合颗粒的熔融温度(Tm)和熔化焓(ΔHm)，纳米颗粒的熔融温度随着卵磷脂质量比的增加逐渐提高，在比例为0∶1和1∶1的玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素复合纳米颗粒观察到了槲皮素的特征吸热峰，分别为118.58和119.71 ℃，这表示结合了槲皮素的纳米颗粒分散均匀。与其他颗粒相比，比例为1∶2的纳米颗粒在约130.88 ℃下显示出最高的吸热峰，并且有相对较低的熔化焓(87.49 g/g)，表明它的热稳定性很高[16]。卵磷脂的存在可以增强纳米颗粒中不同组分之间的相互作用，例如疏水效应和静电相互作用，导致高吸热峰温度[12]。研究表明，β-乳球蛋白和磷脂之间的疏水相互作用也可以增加蛋白质的热稳定性[17]。

表2 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素纳米颗粒的DSC表Table 2 DSC of zein-lecithin-quercetin nanoparticles

2.4 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素纳米颗粒溶液的稳定性

由表3中看出，卵磷脂单独包埋槲皮素的粒径要小于玉米醇溶蛋白，电位值为-18.8 mV。而玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素纳米颗粒随着卵磷脂含量的增加，粒径尺寸向不稳定趋势变化而电位无显著变化。在玉米醇溶蛋白与卵磷脂的质量比为10∶1和5∶1时，复合纳米颗粒的粒径偏大，平均分别为459.03和324.66 nm，PDI均在0.3以上，电位值从-29.43到-28.27mV。该结果与FU等[18]提出的zein初始质量浓度过高会影响纳米颗粒粒径的假设结果一致。然而，玉米醇溶蛋白与卵磷脂的质量比为1∶1、2∶3和1∶2的颗粒粒径相对较小，PDI也降低至0.2以下，可能是由于玉米醇溶蛋白与卵磷脂形成紧密结构，从而减小复合纳米颗粒的尺寸。与单一的卵磷脂或玉米醇溶蛋白包埋槲皮素相比较，三元复合颗粒的电位值均在-25 mV以上，说明疏水性卵磷脂在颗粒内部和可能在颗粒表面上的浓度增加降低了复合纳米颗粒的ζ-电位[19]。结果表明增加卵磷脂浓度极大地提高了玉米醇溶蛋白-槲皮素溶液的稳定性。

表3 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素纳米颗粒溶液粒径、电位值和PDITable 3 Zein-lecithin-quercetin nanoparticle solution particle size, potential value and PDI

2.5 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素纳米颗粒溶液的溶解稳定性

从图3看出，放置3 d后，单一包埋槲皮素的玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白卵磷脂质量比为2∶1的溶液底部均出现了轻微沉淀。30 d后能明显观察到单包埋槲皮素的玉米醇溶蛋白和卵磷脂，与玉米醇溶蛋白浓度高的溶液均有明显沉淀，溶液逐渐偏清，说明包含的槲皮素已经与溶液分离。除了质量比为1∶1的溶液底部出现轻微沉淀外,质量比1∶2和2∶3的溶液稳定，无明显变化，分布均匀，包埋效果好，适合长期存放。

图3 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素纳米颗粒溶液溶解稳定性Fig.3 Solubility stability of zein-lecithin-quercetin nanoparticle solution注：玉米醇溶蛋白单独包埋槲皮素和卵磷脂单独包埋槲皮素的样品分别在图中显示100∶0和0∶100。

2.6 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素纳米颗粒的扫描电镜结果

单一由玉米醇溶蛋白包埋的槲皮素颗粒有较大的颗粒存在,如图4-a所示，与其粒径有关，且颗粒间存在聚集状态，这与黄旭琳等[20]研究结果一致。

图4 纳米颗粒扫描电镜图Fig.4 The SEM of the nanoparticles注：a-1∶0；b-10∶1；c-5∶1；d-2∶3；e-1∶2。

加入卵磷脂后样品颗粒结构比较紧密，呈现圆形，有明显黏连，并随着卵磷脂质量比的增大呈现相对疏松且分布更均匀的颗粒分子，可能由于卵磷脂与玉米醇溶蛋白的疏水性作用增强后提高了溶液的界面活性，有利于复合颗粒更均匀分布[21]。

2.7 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素纳米颗粒溶液的抗氧化性质

由图5可知，相比于玉米醇溶蛋白单独包埋槲皮素，卵磷脂DPPH自由基清除率显著，达到96%，而其总抗氧化能力很低。当玉米醇溶蛋白与卵磷脂质量比从10∶1增加到2∶3时，DPPH自由基的清除能力显著下降(P<0.05)，但继续增加到1∶2时，DPPH+·开始呈现上升趋势，DPPH自由基清除能力增强。玉米醇溶蛋白质量比较高时，总抗氧化能力较低，卵磷脂比例增加达1∶1和1∶2，总抗氧化能力极其显著(P<0.05)，分别为28.2和34.6 μmol/mL，提高了玉米醇溶蛋白包埋槲皮素的抗氧化能力。而 2∶3时，总抗氧化偏低可能是其受DPPH自由基清除率影响比较大。结果表明，不同质量比的玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素纳米颗粒溶液抗氧化能力不同，比例1∶2和1∶1的综合性能最优。

图5 玉米醇溶蛋白-卵磷脂-槲皮素纳米颗粒溶液的DPPH和总抗氧化能力Fig.5 DPPH and total antioxidant capacity of zein- lecithin-quercetin nanoparticle solution

3 结论

当玉米醇溶蛋白与卵磷脂质量比为1∶2时,包封率达到最大，为73.2%,装载率2.9%，且其热稳定较强，总抗氧化性能优，达到34.62%。由此表明,质量比为1∶2的玉米醇溶蛋白-卵磷脂复合纳米颗粒可作为槲皮素的有效载体应用于其活性的保护与长效利用。因此，玉米醇溶蛋白-卵磷脂复合纳米粒子可能是水不溶性生物活性化合物的潜在递送系统，具有增强的包封效率和化学稳定性。