秸秆替代全株四棱豆对全混合日粮发酵品质及有氧稳定性的影响

邱小燕，奚恺锋，谢新辉，田玉桥，伍贤进，曾军英，邵涛，姚元枝*

1(怀化学院 生物与食品工程学院，湖南 怀化，418008)2(湖南农业大学 园艺园林学院，湖南 长沙，410123)3(民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湖南 怀化，418008)4(湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室,湖南 怀化，418008)5(南京农业大学 饲草调制加工与贮藏研究所，江苏 南京，210095)

近年来，饲料短缺已成为制约畜牧产业迅速发展的重要因素。发酵全混合日粮(total mixed ration, TMR)是指TMR在厌氧环境下经过乳酸菌发酵，最终配制成营养相对平衡的日粮[1]。近年来，发酵TMR已被广泛用于奶牛的饲喂，而且将农副产品及食品副产物调制成发酵TMR的趋势也在逐渐增加[2-3]。TMR经过发酵能产生特别的酸香味，提高奶牛的食欲，有利于奶牛的生长和发育。丁良等[4]用不同比例笋壳逐步替代全株玉米调制成发酵TMR，25%替代组不仅有良好的发酵品质而且有氧稳定性高。WANG等[5-6]将蘑菇渣、绿茶渣等农副产物调制成发酵TMR，获得了品质优良、营养均衡的全价饲料。WEINBERG等[7]将含有玉米酒糟的发酵TMR保存140 d后，其发酵品质和有氧稳定性均良好。SRITA等[8]用40%的土豆渣和豆腐渣替代精料调配成发酵全混合日粮，发酵品质较好，且采食率没有显著变化。王勇等[9]以全株玉米和青稞秸秆为主要粗饲料的TMR配方基础上，用苜蓿、全株燕麦和小麦秸秆按不同比例替代全株玉米，30%全株玉米替代组可应用于生产实际。因此，推广发酵TMR技术已成为促进农区畜牧业发展的重要措施。

四棱豆(PsophocarpustetragonolobusL.)为菜豆族四棱豆属的栽培种，是一种攀援类植物，高度一般在3～4 m。四棱豆不仅蛋白质含量高，且富含必需氨基酸[10]，但四棱豆种植面积较少，作为饲料的精粮成本颇高。中国是农作物秸秆产出大国，年总量达5.2×108t以上[11]，大量秸秆随地堆弃和任意焚烧对环境造成严重污染[12]。因此，秸秆饲料化已成为促进农区畜牧业发展的重要措施，不仅可以减少资源的浪费和环境的污染[13]，还能带动畜牧经济的增长。但是秸秆质地粗糙、适口性差，干物质和粗纤维含量高，且可溶性碳水化合物含量低，自然附着的乳酸菌数量少[14]，所以常规青贮很难调制出高品质的青贮饲料。若能用秸秆代替部分四棱豆制成发酵TMR，不仅可以弥补秸秆蛋白质含量不足、适口性差的缺陷，也能降低饲料成本。可见，若将秸秆替代四棱豆，调配成发酵TMR，既可以解决优质饲料资源受限的问题，又能充分利用农副产品，变废为宝。

本试验以水稻秸秆、玉米秸秆、全株四棱豆、精料为原料调配成不同比例混合的发酵TMR，研究不同秸秆替代水平对TMR发酵品质及有氧稳定性的影响，旨在筛选出品质较好的发酵TMR，为农区生产优质的发酵TMR提供技术支撑，促进畜牧业的可持续发展。

1 材料与方法

1.1 实验材料

如表1所示，TMR由水稻秸秆、全株四棱豆、玉米秸秆和精料构成。四棱豆处于结荚期，水稻秸秆和玉米秸秆分别为水稻和玉米去除籽实后的秸秆，精料由玉米粉、豆粕、菜粕、棉粕、酒糟蛋白饲料(distillers dried grains with solubles, DDGS)、麦麸、预混料和食盐以适当的比例混合而成，玉米粉、豆粕、菜粕、棉粕、麦麸、DDGS从饲料市场采购。

表1 TMR原材料营养成分Table 1 Chemical composition of original material of TMR

注:FW: fresh weight，鲜重; DM:dry matter，干重；精料：质量分数30%玉米粉，4%豆粕，12%菜粕，8%棉粕，15%DDGS，20%麦麸，9%预混料，2%食盐(DM)。

1.2 实验设计

秸秆按照设定比例逐步替代全株四棱豆，与精料调配成发酵TMR，其中秸秆所占TMR的质量分数依次为10%(A)、20%(B)、30%(C)、40%(D)，如表2所示。对每个处理进行营养特性、发酵品质及有氧稳定性的研究，共4个处理，每个处理设置3个重复。发酵35 d后打开青贮袋，分别在第0、3、6、9、12、15天测定有氧稳定性，并测定相应指标变化。

表2 TMR的组成 单位：%DM(质量分数)

1.3 发酵TMR调制

将水稻秸秆、玉米秸秆和全株四棱豆用铡刀切割至1～2 cm，并按照设定的配方配比混合均匀，装入8 kg TMR于青贮袋中，同一个处理5个重复，抽真空发酵。

1.4 样品预处理

在预定的青贮发酵天数打开青贮袋，取出发酵TMR并混匀，样品分为3份，一份用于浸提，得到的浸提液置于-20 ℃冰柜中保存待测；一份样品烘干粉碎保存待测；一份用于微生物计数。

1.5 感官评分

青贮饲料的发酵品质评定选用V-Score[15]评价体系，以青贮饲料中所含的氨态氮/总氮(NH3-N/TN)和挥发性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)含量来评定发酵品质的优劣，并将各项得分相加获得最终评价分数，根据这个评价体系，将青贮饲料品质分为满分(100分)、良好(>80分)、中(60～80分)、差(<60分)4个等级，具体评分标准见表3。

表3 青贮饲料V-Score评分体系Table 3 V-Score evaluation for silage

注：NH3-N:氨态氮；TN:总氮。下同。

1.6 测定指标及方法

干物质采用65 ℃，48 h干燥法测定[16]；pH值用雷诺精密pH计测定；乳酸和挥发性脂肪酸采用GC-2014气相色谱仪测定；粗蛋白采用凯氏定氮法测定[17]；氨态氮含量采用苯酚-次氯酸钠比色法测定[18]；水溶性碳水化合物含量采用硫酸-蒽酮比色法测定[18]；粗脂肪含量采用残余法测定[16]；粗灰分采用灼烧法测定[16]；乳酸菌采用琼脂培养基培养、好氧性细菌采用营养琼脂培养基培养、酵母菌采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养，乳酸菌在37 ℃厌氧条件下培养2～3 d；好氧性细菌和酵母菌用生化培养箱37 ℃分别培养1～3 d，计数。

1.7 有氧稳定性测定

青贮35 d后，进行有氧稳定性测定，青贮袋打开后，放置于25 ℃恒温室内，用ZDR温湿度记录仪测定青贮饲料中心处温度，利用热点偶原理，每30 min自动记录青贮饲料中心处的温度[19]，同时相应的取样测定青贮饲料的pH值，乳酸碳水化合物、乙酸、丙酸、丁酸含量及微生物数量的变化。

1.8 数据处理方法

试验数据先用Excel软件处理，再用SPSS 22.0软件进行显著性分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 TMR营养及微生物成分

如表1所示，水稻秸秆及玉米秸秆的粗蛋白及水溶性碳水化合物含量都较低，粗灰分含量较高，四棱豆的粗蛋白含量较高。发酵前不同TMR组的营养及微生物成分如表4所示，随着秸秆替代水平的增加，发酵TMR的干物质和粗蛋白含量呈下降的趋势，水溶性碳水化合物含量则显著(P<0.05)降低。各组粗脂肪和粗灰分含量无显著性差异。各组乳酸菌(>4.0 lg CFU/g FW)和好氧性细菌数量无显著性差异，C组的酵母菌数量显著(P<0.05)高于A组和B组，其他3组酵母菌数量没有显著性(P>0.05)差异。

表4 TMR的营养和微生物成分Table 4 The chemical and microorganism composition of TMR

2.2 TMR的发酵品质

各组TMR的V-Score评分结果如图1所示，C和D组的品质得分显著(P<0.05)高于A组，B组与其他3组间品质得分无显著性差异(P>0.05)。由表5可知，发酵35 d以后，C和D组的pH值显著(P<0.05)低于B和A组，相应的C和D组的乳酸含量显著(P<0.05)高于B和A组。4组的乙酸、丙酸和丁酸含量都较低，A组的氨态氮/总氮显著(P<0.05)高于各替代组，B和D组氨态氮/总氮显著(P<0.05)低于C组，D组的水溶性碳水化合物含量最高，显著(P<0.05)高于B和C组。

图1 不同处理对TMR发酵品质得分的影响Fig 1 Effects of different treatment on the fermentation quality score of TMR

表5 青贮35 d后TMR发酵品质Table 5 The fermentation quality of TMR after 35 days of fermentation

注：不同小写字母表示不同处理组间的差异显著(P<0.05)。下同。

2.3 有氧暴露阶段发酵TMR pH值、乳酸、水溶性碳水化合物、乙酸、丙酸和丁酸含量的变化

不同替代比例的TMR有氧稳定性如图2所示。D组的有氧稳定性显著(P<0.05)高于A和C组，与B组无显著(P>0.05)性差异，达到360 h，A组有氧稳定性最低。

图2 青贮35 d后不同处理对TMR有氧稳定性的影响Fig 2 Effect of different treatment on the aerobic stability of TMR after 35 d of ensiling

如表6所示，B和D组pH值在整个有氧暴露过程中没有明显的变化，A组和C组的pH值在有氧暴露第9天显著(P<0.05)上升，显著(P<0.05)高于B和D组。在TMR发酵产酸方面，A、C和D组乳酸含量在有氧暴露第15天显著(P<0.05)下降到最低值，B组乳酸含量呈下降的趋势(P>0.05)，有氧暴露9 d后，A组的乳酸含量在整个有氧暴露阶段均低于其他各组。A和C组水溶性碳水化合物含量在有氧暴露第9天均显著(P<0.05)下降，D组在第12天显著(P<0.05)下降，B组呈下降(P>0.05)的趋势，D组水溶性碳水化合物含量在整个有氧暴露阶段均高于其他3组。各组间乙酸含量都呈先下降后上升的变化趋势，其中A组乙酸产量最少，在有氧暴露第9 d后B组乙酸含量显著(P<0.05)高于其他3组；只有D组的丙酸含量呈先上升后下降的趋势，其他组均为下降的变化趋势；A组和B组丁酸含量在整个有氧暴露过程中无显著性变化(P>0.05)，D组丁酸含量在有氧暴露第15天显著(P<0.05)上升，并显著(P<0.05)高于其他3组。

表6 有氧暴露阶段发酵TMR pH值、乳酸、水溶性碳水化合物、乙酸、丙酸及丁酸含量的变化Table 6 Changes of pH value, lactic acid, water soluble carbohydrate, acetic acid, propionic acid, butyric acid contents in TMR during aerobic exposure stage

注：不同大写字母表示相同有氧暴露时间不同处理组间的差异显著(P<0.05)。下同。

2.4 有氧暴露阶段发酵TMR微生物数量的变化

如表7所示，各组的好氧性微生物数量随着有氧暴露时间的增加均呈上升的变化趋势，在有氧暴露第15天各组好氧性微生物数量最高，其中C组好氧性微生物数量在有氧暴露第0天显著(P<0.05)低于A组，D组在有氧暴露第12天显著(P<0.05)高于其他3组。各组酵母菌的数量随着有氧暴露天数的延长均呈先上升后下降的趋势，其中B组在有氧暴露第0天及第12天分别显著(P<0.05)低于C组及A组。在刚拆袋(0 d)打破厌氧环境时，各组乳酸菌数量均处于较高水平(>6 lg CFU/g)。除D组呈先上升再下降的趋势外，其他3组乳酸菌数量随着有氧暴露天数的延长一直下降。

3 讨论

青贮是指水溶性碳水化合物被乳酸菌利用，代谢产生有机酸(主要是乳酸)降低pH值，从而抑制有害微生物活性使饲料能够长期贮藏[20]。因此，pH成为判断青贮后青贮饲料品质优劣的重要指标，水溶性碳水化合物含量及乳酸菌数量成为影响青贮品质的重要因素。一般认为，青贮原料的乳酸菌数量达到5 lg CFU/g FW，水溶性碳水化合物含量超过25～35 g/kg DM，才能获得优质青贮饲料[21]。许能祥等[22]通过添加米糠以补充稻草中可溶性碳水化合物的不足，增加发酵底物，获得品质较好的混合青贮饲料。本试验各组TMR原料水溶性化合物含量均在45 g/kg DM以上，乳酸菌数量均接近5 lg CFU/g FW，各组TMR发酵品质均属良好，也可以从较低的pH、丁酸和氨态氮的含量得以体现，丁酸和氨态氮浓度的高低直接反应青贮过程中腐败菌的活动情况[23]，一般认为优质青贮饲料的丁酸含量和氨态氮含量应低于10 g/kg DM和100 g/kg TN[24]，本试验中，各组TMR氨态氮和丁酸含量都较低，表明整个青贮过程没有发生腐败尤其是蛋白质的大量分解[24]，这可能与水溶性碳水化合物充足，乳酸菌数量较高，整个青贮过程快速进入乳酸发酵期，乳酸增多，pH值降低，有害微生物活性被抑制，从而保证了青贮质量。开袋后各组TMR的pH值都要高于4.2，这可能与青贮的材料的干物质含量较高有关，原现军等[25]的研究表明青贮饲料干物质含量较高时，pH值在4.5左右，也能使饲料良好保存。

表7 有氧暴露阶段发酵TMR微生物数量变化Table 7 Changes in microbial biomass of TMR during aerobic exposure stage

有氧暴露后，厌氧环境被打破，好养性微生物和酵母菌大量繁殖，水溶性碳水化合物和乳酸被分解成有机酸，且释放热量导致饲料内部温度上升，从而加快腐败的速度，本试验各组TMR水溶性碳水化合物及乳酸在整个有氧暴露阶段均呈下降的趋势，其中，10%和30%替代组下降的幅度较大。TMR开袋后，直接接触空气，pH值的变化可以直观地反映其腐败速度和程度，pH值较低，蛋白质降解可以被有效地抑制[26]。10%和30%替代组的pH值在有氧暴露9 d后，分别显著上升至5.82和4.83，20%和40%替代组pH值在整个有氧暴露过程中没有明显的变化。大量研究表明酵母菌是引起青贮饲料有氧腐败的主要微生物，HAO等[27]研究发现，Zygosaccharomycesbailii数量的增加会引起TMR在有氧暴露期间有氧变质，CARVAIHO等[28]研究表明，Candida、Schizosaccharomycespombe和Zygosaccharomycesbailii，是降低青贮饲料有氧稳定性的主要微生物。本试验10%替代组的酵母菌数量在有氧暴露第12天显著上升，这表明10%替代组和30%替代组在有氧暴露第9天开始腐败，这可能与20%和40%替代组的乙酸含量较高有关，乙酸是一种主要挥发性脂肪酸，含量多少反映醋酸菌的活动情况，乙酸含量是预测发酵TMR有氧稳定优劣的重要指标，乙酸的解离程度低，会以被动运输的形式进入微生物细胞内，降低其胞内pH值，破坏细胞的酸碱平衡，从而杀死细胞，抑制酵母、好养性微生物的生长繁殖[29]。邱小燕等[30]在研究糖蜜和乙酸对发酵TMR品质及有氧稳定性影响时表明乙酸浓度越高，有氧腐败的时间会相应的延长。SCHMIDT等[29]的研究亦表明，乙酸含量越高，青贮饲料有氧腐败的时间相应延长。

4 结论

综上所述，30%和40%替代组发酵35 d后显示良好的发酵品质，pH值较低(4.2左右)，乳酸含量较高，氨态氮/总氮值低于对照组，但30%替代组的有氧稳定性较低，而40%的有氧稳定性较高，同时从秸秆最大化利用角度出发，用40%的秸秆替代发酵TMR中四棱豆最为适宜。本研究中发酵TMR的有氧稳定性并没有随着秸秆替代比例的升高而降低，40%替代组仍保持了较高的有氧稳定性的机理还有待进一步研究。