针灸治疗慢性疲劳综合征肠道菌群-免疫功能的作用机制❋

朱凤亚，江泰君，汤莉洁，刘正康，吴 曦

(成都中医药大学，成都 610075)

慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome，CFS)是以不明原因引起的反复或持续发作6个月及以上的慢性疲劳为典型表现，或伴随低热、头痛、咽痛、淋巴结痛、关节疼痛、肌肉酸痛、睡眠障碍、焦虑、抑郁等多种躯体及精神神经症状为特征的临床综合征[1-2]。CFS估计在全球的患病率为0.8%～3.5%，发病率约为0.4%～1%，男女发病比例约1∶6，青少年也有不同程度的发病[3-4]。大量研究发现，CFS 发病与机体免疫异常关系密切，而CFS免疫异常的相关证据表明，潜在的病理机制可能是由于肠道生态失调[5]。针灸可有效改善CFS症状，但发病机制尚不明确，已有研究开始从肠道菌群出发探索与CFS免疫功能异常的相关机制。本文概述CFS、肠道菌群和免疫功能的相互关系以及针灸的调控作用，并进一步提出针灸调控CFS肠道菌群，从而改善机体免疫功能稳态的可能机制。

1 CFS与肠道菌群的作用机制

1.1 CFS存在肠道菌群结构及功能紊乱

在宿主-菌群共生关系中，肠道菌群通过与机体物质交换及代谢维持肠道内环境稳态，在维护机体健康和疾病发生发展中意义重大。研究显示，CFS发病可能与肠道菌群失调有关。Butt H[6]等首次提出CFS患者与健康人相比粪便微生物群改变的证据，Sheedy JR[7]等做了相同分析，2项研究均发现产生D-乳酸的肠球菌和链球菌在CFS患者中的比例明显升高，双歧杆菌水平明显降低；而在厌氧菌中，普氏菌作为一个细菌属，其比例高于健康者。Fremont[8]等使用高通量16S rRNA基因测序观察来自比利时和挪威的CFS患者，发现肠道微生物群中特定改变的存在，肠道菌群多样性减少。近年来相关研究进一步对菌群进行靶向定性和定量分析，对CFS患者粪便进行菌群多样性及丰度测定，作为肠道厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门四大菌门，CFS患者厚壁菌门丰度明显降低，放线菌门中的双歧杆菌明显下降，而变形菌门丰度增加至正常值的2倍，拟杆菌门变化则不明显[9]。此结果在另1项对患有CFS的双胞胎进行菌落测定的研究中得到验证[10]。Shukla SK[11]等观察到，在CFS患者血液中拟杆菌门相对丰度较低且厚壁菌门的相对丰度高；反之在粪便样本中，拟杆菌门的相对丰度更高而厚壁菌门的丰度更低，说明肠道菌群中拟杆菌门-厚壁菌门的丰度比例失衡。此外，CFS患者在运动后的48 h内血液中芽孢杆菌的相对丰度显著增加。以上证据表明，肠道菌群失调可能是引起CFS发病的重要机制之一。

1.2 针灸对CFS肠道菌群的调节作用

已有研究表明，肠道菌群生态失衡会导致诸多疾病的发生，主要包括内分泌系统疾病、心脑血管疾病、炎症性肠病、自身免疫性疾病及肥胖、肿瘤、癌症等[12]。目前，针灸对肠道菌群的研究主要集中在两方面，一是调整肠道菌群的数量和比例，以恢复其稳定性；二是通过促进肠道菌群和脑-肠轴(脑-肠肽)之间的相互作用改善胃肠动力障碍，并通过降低促炎细胞因子的水平抑制炎症反应，从而改善肠黏膜屏障功能[13]。譬如单纯性肥胖患者存在体内肠道微生态失衡，肠球菌、肠杆菌数量减少，拟杆菌丰度降低，针灸可有效调节肠道菌群紊乱，恢复机体微生态平衡[14]；而对溃疡性结肠炎模型大鼠肠道微生态测序发现，拟杆菌门和变形菌门的细菌总量下降，厚壁菌门上升，电针可调节相应菌群数量趋于正常化，且上调乳酸杆菌和毛螺杆菌[15]；中药联合针灸天枢穴能有效升高肝硬化患者乳酸杆菌和双歧杆菌数量，同时明显降低肠球菌和肠杆菌总数[16]，提示针灸可作用于不同穴位有效调节肠道菌群功能和结构，改善菌群丰度比例和多样性[17]。相关研究表明，CFS也存在肠道黏膜破坏，黏膜通透性增加引起菌群紊乱。成泽东[18-19]通过细菌培养对CFS模型大鼠肠道菌群定量检测后发现，肠道双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、肠球菌的含量降低，温和灸神阙、关元可有效升高肠道中双歧杆菌、乳酸杆菌2种厌氧菌及大肠杆菌、肠球菌2种需氧菌的菌群数量, 调整肠道菌群失调。综上所述，针灸对肠道菌群包括对CFS肠道菌群有明显的治疗和调节作用，但针灸如何在平衡肠道微生态中发挥治疗CFS的作用机制值得进一步挖掘。

2 CFS与机体免疫系统相关机制

2.1 CFS存在免疫功能异常

免疫系统作为机体重要的防御、监视和调控系统，具有识别和排除抗原性异物、与机体其他系统相互协调共同维持机体内环境稳定和生理平衡的功能[20]。研究证实，CFS存在自身免疫功能失调，包括B细胞和T细胞表型以及自然杀伤细胞毒活性(natural killer cytotoxic activity，NKCC)的降低，促炎性细胞因子和免疫球蛋白水平的变化[21]。

2.2 针灸对CFS免疫功能的调控机制

2.2.1 针灸对Th 1 / Th 2的调节 T淋巴细胞作为适应性免疫应答的组成部分，在参与机体免疫系统的功能中发挥作用，辅助性T细胞(简称Th细胞)是促进机体免疫调节的细胞亚群, 既能协助B细胞产生抗体, 又能促进其他T细胞的分化成熟，对机体特异性免疫和非特异性免疫均具有重要调节作用。Th 1细胞和Th 2细胞作为Th细胞主要的2个亚群，二者分别介导机体细胞免疫和体液免疫，γ-干扰素/白介素-4(IFN-γ/IL-4)水平直接反映Th 1/Th 2之间的动态平衡。CFS模型大鼠血清中IFN-γ含量及IFN-γ/IL-4比值降低，说明CFS模型大鼠免疫功能由Th 1向Th 2偏离，细胞免疫功能降低[22]，针刺百会、关元、足三里后血清IFN-γ含量升高，IFN-γ/IL-4比值上升，从而调节辅助性T细胞 Th 1 / Th 2失衡。T细胞特异性转录因子T-bet和GATA-3被认为是影响Th 1 / Th 2分化的关键因素[23]，能客观评定Th 1 / Th 2免疫平衡状态，进一步对Th 1/Th 2极化状态分析后发现[24]，模型组大鼠血浆T-bet基因的表达水平升高，而GATA-3基因表达水平降低，针刺能降低血浆T-bet表达，升高GATA-3表达，调节T- bet / GATA-3比值，由此表明Th 1 / Th 2失衡能够导致CFS免疫功能失调。

2.2.2 针刺对NKCC的调控作用 自然杀伤细胞(NK细胞)作为抵御病原体入侵的第一道防线，在机体适应性免疫应答中发挥着重要作用。大量研究证实，CFS患者存在NKCC显著降低。NK细胞主要包含CD56brightCD16dim/-NK细胞和CD56dimCD16+NK细胞2个亚型，前者主要是具有有效细胞因子产生的免疫监视细胞，而后者主要具有细胞毒性参与感染、肿瘤或免疫缺陷[25]。Nguyen T[26]等报道了CD56brightCD16dim/-NK细胞上的瞬时受体电位3(TRPM3)在CFS中的活性和功能受损，导致细胞质和细胞内储存中Ca2+浓度发生变化，反过来可改变NK细胞的激活阈值，继而影响NKCC。Trotta R等[27]报道了升高的转化生长因子-β(TGF-β)抑制蛋白Smad3磷酸化，从而降低CD16+介导的NKCC，主要通过抑制IFN-γ和正向调节因子T-bet的产生，并降低颗粒酶A、颗粒酶B蛋白和mRNA的表达来实现。通过细胞程序性死亡-配体1(programmed cell death 1 ligand 1, PD-L1)单克隆抗体特异性阻断PD-L1，可促进IFN-γ、IL-2分泌，进而增强NK细胞对靶细胞的杀伤活力[28]。徐福兰等[29]通过针刺结合耳穴贴压的方法治疗肝郁脾虚型 CFS 患者，其疲劳情况、抑郁症状、健康状况均有改善，并能提升患者的NK细胞活性及IgG表达水平；夏德鹏[30]采用穴位埋线配合隔姜灸能有效改善脾肾阳虚型CFS患者NK细胞活性；于茜楠[31]运用电针同样改善CFS模型大鼠的行为学表现及其NKCC。以上研究证明，NKCC与机体免疫功能关系密切，其杀伤活性的降低可能是引起CFS免疫异常的关键原因之一，而针刺可有效提高NKCC，进一步恢复机体免疫功能，改善CFS症状。

2.2.3 针灸对细胞因子的调节 细胞因子(cytokine，CK)是由白细胞和非免疫细胞共同诱导的免疫系统蛋白介体，它们在感染和炎症中共同协调机体免疫应答，人体细胞因子水平出现异常易引起炎症反应[32]，从而导致疾病的产生。促炎性细胞因子产生特点与CFS的症状十分相似[33]。Montoya JG等[34]对患者血清细胞因子检测后发现，有17种细胞因子与CFS的严重程度有关，包括CCL11、CXCL1、CXCL10、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL- 7、IL-12p70、IL-13、IL-17、Leptin、G-CSF、GM-CSF、LIF、NGF、SCF和TGF-α，其中有13种促炎性因子水平升高，有8种细胞因子与疲劳持续时间呈负相关。Hornig M等[35]采用相同技术对病程持续3年以上(长期组)和3年以下(短期组)的CFS患者进行分析，发现短期组51种细胞因子中有28种表达上调，但长期组水平正常或低于正常水平。2个实验结果表明，细胞因子水平的异常与疲劳程度之间是否存在因果关系尚有争议。进一步研究显示，在CFS模型大鼠海马区IL-1β、IL-6及TNF-α含量显著升高[36]，艾灸可以显著下调海马促炎性细胞因子IL-6的表达，IL-1β、TNF-α含量有下降的趋势，并抑制海马小胶质细胞的活性，提示艾灸可以缓解CFS大鼠脑内炎症反应。在患者外周血中同样检测到IL-4、IL-6、IL-10、IFN -γ、TNF -α和新蝶呤水平升高[37-39]。安贵霞、郑盛惠等[40-41]发现，针刺可有效上调血清IL-2、TNF-α 和IFN-γ 水平，表明CFS发病可能与细胞因子水平异常引起的机体免疫功能紊乱有关，针灸通过调节细胞因子水平可改善CFS免疫功能，继而达到治疗目的。

2.2.4 针灸对免疫球蛋白的调节 此外，CFS存在免疫球蛋白降低，Ig A、Ig M、Ig G对宿主机体有防御和抗感染作用。C3、C4作为补体系统中主要的特异性效应因子，在介导机体免疫、维持免疫功能稳定中起重要作用[42]。从CFS患者及模型大鼠中均表明，血清Ig A、Ig M、Ig G水平下降[43-44]。成泽东[45]等温和灸关元穴能增高血清IgA、IgM、IgG的含量至正常水平，维持免疫功能的稳定，其结果在林玉敏[46]等的研究中进一步得到验证，同时发现补体C3、C4水平均降低，经艾灸气海、关元后血清IgA、IgG、补体C4水平均较治疗前升高，故推测机体免疫球蛋白低下也可能是诱发CFS免疫功能紊乱的原因之一。

3 针灸可通过调节肠道菌群来改善CFS免疫功能

肠道菌群的功能结构及正常代谢在平衡肠道内环境及介导宿主机体免疫应答中发挥着重要作用，而这种平衡机制主要体现在通过肠黏膜通透性限制细菌流动和防止炎症反应[47]。证据表明，肠道菌群通过代谢免疫刺激物使肠黏膜上皮细胞分泌炎性细胞因子，从而维持肠道免疫系统的正常生理功能。反之，通过肠道免疫功能控制细菌过度外流，进而维持机体免疫应答。其发挥作用的过程分两步，首先控制肠道细菌和肠上皮细胞表面之间的直接接触，进而通过控制细菌穿过肠黏膜，一方面确保肠道菌群为宿主提供营养物质，另一方面维持肠黏膜内外细菌的稳定性[48]，故肠道菌群与机体免疫功能关系密切。肠道微生物群受到干扰引起菌落生态失调可导致慢性炎症性疾病，譬如大肠杆菌分泌的革兰氏阴性菌脂多糖(LPS)在外周血单核细胞中产生NF-κB依赖性细胞因子，通过识别和激活TLR4复合物负责免疫信号传导[49]，CFS患者NF-κB水平升高并增加自身反应性B细胞的存活[50]，伴随B细胞活化因子(BAFF)上调，BAFF调节B细胞的发育存活及耐受性，在CFS患者中BAFF水平升高，受TNF因子的刺激介导B细胞产生大量IL-10引起机体免疫反应[51]。活化的NF-κB刺激TNF-α和IL-1β的转录，从而导致炎症信号的扩增[52]，TNF-α和IL-1β通过激活NF-κB引起肠内皮细胞通透性增加并破坏内皮细胞紧密连接，使LPS移位至肠系膜淋巴结，大量释放内毒素导致免疫炎症反应[53-54]。此外，CFS患者肠道通透性增加引起对LPS的免疫应答，血清LPS中IgA水平明显升高[55]。进一步证据显示，CFS伴随革兰氏阴性肠杆菌通过肠壁的内毒素转运增加，表现为血清IgM和IgA的过度释放，说明肠黏膜屏障受损，肠道通透性增加或肠道渗漏引起菌群移位，进而引起CFS免疫异常。故基于上述内容表明，CFS、肠道菌群与机体免疫功能关系密切，鉴于针灸对三者的良性调节作用，提出针灸可通过调节肠道菌群来改善CFS免疫功能的作用机制。

4 结语及展望

微生物多样性在肠道中确保微生物群产生一致免疫调节作用能力的稳健性，宿主通过免疫系统抵挡病原体的入侵，肠道菌群在调节和平衡机体免疫功能中起重要作用[47]。前文详细概述了CFS存在肠道微生态失衡，具体表现为肠道黏膜屏障破环使肠黏膜通透性增加，加快菌群肠内外流动引起菌群失调，而针灸可通过改善肠道菌群丰度和多样性调节肠道菌群紊乱。CFS存在Th 1/Th 2失衡、NKCC降低、炎症细胞因子表达异常、免疫球蛋白低下，这可能是CFS免疫异常的重要机制，针灸调节CFS免疫功能已经得到研究证实。菌群多样性和丰度发生改变可导致机体免疫应答异常。因此，通过对CFS、肠道菌群及免疫功能三者的关联性以及针灸对CFS、肠道菌群和机体免疫系统的良性调节作用推测，针灸可通过改善肠道黏膜屏障调控肠道菌群内外平衡，从而维持CFS机体免疫稳态以达到治疗目的。

但目前对针灸是如何通过调节肠道菌群以改善CFS免疫稳态的研究较少。据相关研究，LPS可直接刺激单核/巨噬细胞产生新喋呤，新蝶呤的产生和免疫细胞的活化直接相关，是反映其细胞活化的灵敏指标[56]。进一步研究表明，LPS代谢水平是肠道损伤的关键炎性标志[57]，LPS也可刺激大脑区域促炎细胞因子的释放并产生疾病行为，其致病机制是LPS通过激活单核吞噬受体，使其释放TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子诱发免疫炎症反应[58-59]。杨玉琳[60]通过针刺可降低LPS诱导的慢性炎症性疼痛TNF-α的表达，高燕[61]对LPS致炎大鼠肺等各脏器免疫物质检测后发现，TNF-α、IL-2、TGF-β含量在不同脏器间有明显差异性，其中脾脏、胸腺TNF-a含量最高，艾灸肺俞穴可双向调节各炎症细胞因子水平，从而减轻LPS致炎大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)受抑制现象。故本文提出肠道菌群紊乱-LPS过度释放-巨噬细胞释放炎性细胞因子可能是CFS免疫异常的中心枢纽，LPS代谢刺激免疫炎性细胞因子可能是CFS免疫异常的重要环节。从CFS与宿主-肠道菌群-免疫的共生关系出发，探索针灸调节肠道菌群生态失衡，改善肠黏膜通透性，进而抑制LPS过度释放，调控巨噬细胞过度刺激免疫炎症细胞因子，最终改善CFS免疫异常的重要机制意义重大，利用宏基因组学、转录组学、代谢组学、蛋白组学、现代生物信息学等技术进一步探讨针灸治疗CFS多环节、多靶点的效应机制。