间充质干细胞治疗与自然杀伤细胞的相互作用①

李华杰 王福生 施 明

(北京大学三〇二临床医学院，解放军总医院第五医学中心感染性疾病诊疗与研究中心，北京 100039)

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)有干细胞分化特性，但其分化能力有限，在许多疾病的治疗中，MSCs通过可溶性细胞因子发挥的诱导分化、免疫调节能力，是其更加关键的治疗机制。MSCs发挥的免疫调节能力影响着免疫系统的各个方面，其中TGF-β、NO/IDO、PGE2对自然杀伤细胞(nature killer cell，NK细胞)有着重要作用并借此影响着治疗效果[1]。NK细胞是固有免疫中无须预先抗原刺激与活化，即能够直接杀伤被病毒感染的细胞或肿瘤细胞的一群细胞。NK细胞广泛分布于骨髓、肝脏、淋巴结、脾脏、肺脏和黏膜等器官。NK细胞根据其分化状态可分为过渡型NK和成熟型NK，其表型各异，可根据需要向各类器官或组织迁移并进一步成熟分化。NK细胞有多种亚群，根据表达CD56分子密度可分为杀伤功能为主的CD56dim亚群和分泌细胞因子为主的CD56bright亚群[2]。NK细胞表达许多表面抑制性和活化性受体，在不同疾病中发挥不同的作用，影响着疾病进展，是MSCs治疗的靶点之一。

1 MSCs与NK细胞的相互作用

1.1MSCs对NK细胞的作用 现有研究普遍认为MSCs发挥免疫抑制效应，无论静态细胞模型还是模拟感染和组织损伤的动态模型，都发现MSCs会抑制NK细胞以减弱炎症反应[3-5]。MSCs不仅会影响NK细胞表面分子表达，如共培养后MSCs对NKp30、NKp44、和CD69等表达的抑制[6]，还会抑制其增殖和发挥功能(细胞因子分泌及细胞毒作用)[7]，如斑秃小鼠模型中MSCs可通过抑制NKG2D来控制毛囊炎症[8]。在应用CCl4建立的肝炎小鼠模型中发现，应用IFN-γ、TGF-β等细胞因子预处理的MSCs在小鼠体内更倾向分布于肝脏，且其免疫调节能力会进一步升高，炎性因子的下降和其对NK细胞裂解敏感性的降低使MSCs的更加适用于治疗[9]。

MSCs对各种免疫细胞有抑制效应，但它在特定条件下亦有额外的免疫刺激能力。有研究发现无论健康捐献者还是免疫抑制患者，IL-12和IL-18刺激下的MSCs能促进NK细胞释放IFN-γ，高水平表达CCR2的CD56brightNK细胞对MSC的作用更加敏感[10]。MSCs对NK细胞的影响还随时间变化而变化。使用聚肌胞甘酸(poly I∶C)刺激模拟MSCs与NK的相互作用发现，在早期MSCs可通过分泌Ⅰ型干扰素增强NK细胞效应功能，但随后MSC分泌的TGF-β和IL-6又会诱导调节衰老样NK细胞表型，下调炎症反应，限制NK细胞效应功能，反过来促进了MSCs的存活、增殖和促血管生成。以上结果表明MSCs的功能可能会随感染阶段不同而改变[11]。

在一项多中心的临床实验中，62名慢性移植物抗宿主病(chronic graft versus-host disease，cGVHD)患者经过230次输注脐带血间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)(3×107cells/100 ml/per month)后NK细胞数量减少[12]。同时Zhao等[13]证明同种异体移植物中高浓度的NK细胞与急性和慢性GVHD风险增加有关。因此，观察到NK细胞减少可能是MSCs组中cGVHD发生率较低的原因之一。

1.2NK对MSCs的作用 生理条件下，NK细胞可以与组织内除NKT和γδT细胞外其他细胞相互作用，如单核细胞衍生的巨噬细胞和树突细胞，中胚层细胞和细胞外基质成分等，其中就包括MSCs[14]。

MSCs对静息的NK细胞有抑制作用，但对已活化的NK细胞反而有促进作用，可以进一步提高NK细胞毒性[15,16]。各种刺激活化的NK细胞与骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BM-MSCs)共培养均发现，NK细胞分泌IFN-γ和TNF-α增加，且活化NK细胞会杀伤BM-MSCs，诱导BM-MSCs内活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生，减弱细胞活力，降低serpin B9(一种丝氨酸蛋白酶抑制蛋白，抑制粒酶B的释放)表达[17]。MSCs会被IL-2刺激活化的NK细胞溶解，且NK细胞毒性与其CD16表达的减少和CD56表达的升高呈正相关[18]。NK细胞可以攻击MSCs上识别NKG2D和DNAM1的配体，借此诱导杀伤MSCs，释放促炎因子[19]。

体外活化NK细胞对MSCs的杀伤作用可以削弱MSCs的治疗效力，且已有研究发现这种能力不会被免疫抑制药物影响，在培养基内活化前以及活化期NK细胞中添加免疫抑制药物可以减少NK数量但不影响它裂解MSCs的能力[20]。

对这种杀伤作用MSCs并不是完全没有抵抗能力的，MSCs的Toll样受体3与配体的结合可以削弱NK细胞的杀伤[21]。Toll样受体是MSCs重要的表面受体，这些受体传递的信号既影响MSCs对固有性免疫和适应性免疫的调节作用，又影响NK细胞对MSCs的杀伤作用[22,23]，是在活体内MSCs的作用依然占主导而没有被完全杀伤的原因之一。比较细胞因子预处理的UC-MSCs发现，经过细胞因子[TGF-β、IFN-γ、多细胞因子混合物(multiple cytokine cocktail，MC)]处理的脐血MSCs可以免受NK细胞的裂解(与未处理UC-MSCs相比NK细胞CD107a的表达显著降低)[9]。

2 MSCs在治疗中对NK细胞的影响

由于多样化的表面受体、细胞内信号分子及转录因子表达、组织特异性印迹和外来抗原暴露，人们对NK 细胞多样性的认识比最初认为的要广泛得多。尽管多数亚群有共同的CD56brightCD16-显性，但它们受各个组织独特的微环境所影响，因此彼此不全相同[2]。各个组织的NK细胞亚群都具有独特的表型特征，其表型和功能亦不相同。如肝脏富集NK细胞，占肝总淋巴细胞的30%～50%，且CD56bright肝NK细胞亚群占其中40%，远高于外周血比例，它们的表面分子(如CXCR6)表达、颗粒、功能(如产生促炎性细胞因子减少及脱颗粒和细胞毒作用增强)与外周血NK细胞均不同[11]。

因此，机体内的NK细胞在比例、含量、亚群、表达及功能上差异的NK细胞对疾病及治疗有着深刻影响。

2.1NK细胞是MSCs治疗的重要靶点 MSCs与NK细胞会形成一个稳定的炎症-修复系统，既保证了适当的炎症抵御外界侵害的损伤，又避免了过度炎症及组织的破坏。这已经在许多体内外实验中得到验证[11,14]，包括移植物抗宿主病的临床治疗、肝衰竭的治疗等。例如使用MSCs治疗HBV感染的小鼠的实验中，体内成像发现MSCs在受损肝内聚集且肝脏炎性细胞浸润减少，同时抑制HBV感染所需的NK细胞激活性受体NKG2D的表达[24]。

整体上并未观察到NK细胞抑制MSCs的实际疗效，但消除MSCs对NK细胞的影响可以进一步确定MSCs的疗效并可能促进MSCs治疗的优化[20]。如IL-2活化的NK细胞对MSCs的杀伤会因淋巴细胞和MSCs的比例不同而改变，因此研究活化NK细胞对MSCs的影响可能改善MSCs治疗的潜力[18]。

综上，MSCs对NK细胞的抑制主要体现在活化及增殖的削弱，而MSCs发挥功能的前提亦需要炎性环境等激活，未激活的MSCs功能并不明显。因此它们的相互作用促进了MSCs对疾病的治疗。

2.2不同来源MSCs的选择对治疗和NK细胞的影响 尽管MSCs最终会被异体受者的免疫系统清除，但MSCs低表达MHCⅠ类分子，不表达MHCⅡ类分子，这种低免疫原性保护MSCs免受NK细胞的攻击并抵抗移植排斥[25]。不同来源的MSCs对不同的疾病的作用和影响不尽相同，其中UC-MSCs是异体移植中较好的选择[26]。UC-MSCs相比BM-MSCs和脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，AT-MSCs)寿命长、数量多、易于增殖、无侵入性、伦理争议小且p53、p21和p16这些衰老相关标志表达更低[26,27]。长期体外扩增的MSCs可以保持自身的稳定，但其免疫抑制特性会略有下降[28]。

不同来源的MSCs对包括NK细胞在内的免疫细胞影响也不尽相同。使用较多的BM-MSCs与AT-MSCs有着相似的表型，都可以削弱NK细胞的增殖和细胞因子分泌[29]，但只有BM-MSCs明显减弱NK细胞毒作用。此外，它们对其他免疫细胞的作用亦略有不同[30]。

2.3MSCs抑制NK诱导的促肿瘤风险 应用MSCs的免疫抑制功能来减弱免疫损伤可以治疗疾病，但对于有肿瘤风险的患者(而非肿瘤患者)是把双刃剑，可能促使肿瘤形成。在肿瘤形成时，肿瘤内MSCs(肿瘤微环境影响下的MSCs，有分泌能力等的改变)对免疫系统的作用同样是抑制的，可能增加肿瘤风险[3,31]。肿瘤内MSCs通过直接及间接影响调节性T细胞和巨噬细胞对NK有抑制作用，可以促进肿瘤的生长[32]。如肿瘤内MSCs比正常来源的MSCs有更强的免疫抑制性，且对NK细胞亚群影响不同，它们诱导NK细胞CD56dim表型NK增多且抑制CD56bright亚群产生IFN-γ[33]。正常人和乳腺癌患者中的MSCs在同等情况下对NK细胞有相似的抑制效应[34]。

尽管MSCs有促肿瘤风险，但对肿瘤患者可以利用MSCs的肿瘤趋向性来抗肿瘤，如通过基因操作、体外IFN-α或化学试剂处理来调节它们的免疫修饰能力。这样，MSCs可以用于增强抗肿瘤免疫反应或特异运输抗肿瘤信号，并还可作为载体用于运送细胞毒药物直接到肿瘤位点。但基于MSCs的肿瘤治疗应依据肿瘤的类型、定位和阶段以及肿瘤微环境中的免疫状态来选择[3]，因此其在有肿瘤风险患者中的应用安全性还有待商榷。

3 结语与展望

间充质干细胞是干细胞治疗中的优势选择，它具有来源广泛、易于增殖、伦理争议小、免疫原性低、分化潜能高和免疫调节性强等治疗优势。其中，分化潜能在实际治疗中发挥作用较小，而针对时刻变化的疾病状况中错综复杂的免疫系统，MSCs的免疫调节能力可以更加广泛的应对。MSCs如何与免疫系统相互作用，其背后的机制十分值得探究，NK细胞与MSCs的相互作用仅是其机制的一部分，对其机制的进一步研究可为应用MSCs治疗疾病提供理论支撑。尽管活化的NK细胞有杀伤MSCs的作用，但MSCs的治疗作用在过去的许多实践中已经被证实，在各种动物以及人的疾病模型实验中都发挥了积极的作用[35]。且通过不同的处理可进一步改善MSCs的功能以改进治疗效果，活化NK细胞对MSCs的杀伤作用在活体中并未观察到。本篇综述讨论了过去所做的成果以进一步探究背后的机制与意义。NK细胞作为免疫系统的关键环节在疾病发生发展中发挥关键作用，MSCs治疗中，MSCs对NK细胞的抑制作用影响着治疗效果，是治疗机制的一环，可以促进MSCs在治疗上的应用。